郭建軍,熊大維,曾 靜,魏國(guó)汶,袁 林

(江西省科學(xué)院微生物研究所,江西南昌 330096)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)作為能在腸道黏附生長(zhǎng)的乳酸菌[1],具有良好的生物安全性和優(yōu)良的益生特性[2]。在腸內(nèi)能抵抗低pH環(huán)境,比一些腸道“過(guò)路菌”有更強(qiáng)的排斥和競(jìng)爭(zhēng)致病菌的定植[3],還可通過(guò)分泌細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)抑制致病菌[4],同時(shí)糞腸球菌可代謝產(chǎn)生對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如L-乳酸、氨基酸、維生素及酶,提高胃腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平[5],促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),提高飼料轉(zhuǎn)化率[6]。糞腸球菌已逐步發(fā)展成為最具有應(yīng)用前景的抗生素替代品[7-8]。但糞腸球菌的應(yīng)用效果受多種因素的影響[9],如生理狀態(tài)、飼喂方法、溫度和菌制劑的保存時(shí)間等都極易使菌失活,喪失益生特性[7]。通過(guò)微膠囊技術(shù)包被益生菌[10],可有效增強(qiáng)微生物對(duì)高溫、胃酸及膽汁等不良環(huán)境因子的抵抗能力,提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[11],保護(hù)菌體細(xì)胞少受剪切力的影響,進(jìn)而增強(qiáng)益生菌的益生作用[12]。

目前,針對(duì)微生物細(xì)胞的包被技術(shù)多為發(fā)酵后包被[13],存在微膠囊產(chǎn)品得率低、活菌保存量少、能耗和成本較高等問(wèn)題[14],產(chǎn)品活菌含量較低、且粒徑大小不均一,從而造成微膠囊產(chǎn)品包被效果不佳[15-16]。發(fā)酵前包被將微生物活菌包被于微膠囊內(nèi),能夠使糞腸球菌在微膠囊微環(huán)境下大量增殖,保護(hù)細(xì)胞少受剪切力的影響,從而實(shí)現(xiàn)其高密度和高活性的目的[17]。王婷婷等[18]在發(fā)酵前進(jìn)行包被,得到顆粒大小均勻、球形度好、大小均勻的微囊化屎腸球菌固態(tài)產(chǎn)品,明顯提高了屎腸球菌在極端環(huán)境下的存活率,有效地防止了菌體失活[18]。閆穎娟等[19]采用響應(yīng)曲面法對(duì)微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,其細(xì)胞菌密度可達(dá)到3.18×1011CFU/g。張琳等[20]對(duì)糞腸球菌進(jìn)行發(fā)酵前包被制備糞腸球菌膠囊,顯著增強(qiáng)了其對(duì)高溫環(huán)境的耐受性,延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。有關(guān)糞腸球菌包被培養(yǎng)基的優(yōu)化研究仍較少。

本研究以糞腸球菌為對(duì)象,以海藻酸鈉-碳酸鈣微膠囊體[20]進(jìn)行包被,采用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面對(duì)其包被發(fā)酵培養(yǎng)基組成分和含量進(jìn)行了優(yōu)化,確定適宜糞腸球菌高密度包被培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基,以期為工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的糞腸球菌微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞腸球菌EXW27 由江西省科學(xué)院微生物研究所南昌市應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從健康仔豬腸道黏膜上分離純化的優(yōu)勢(shì)菌株[21],體外試驗(yàn)證明,該菌株對(duì)于畜禽具有優(yōu)良的益生潛力;SYTO 9 綠色熒光核酸染料 美國(guó)英杰生命技術(shù)公司;酵母粉、蛋白胨、牛肉膏 安琪酵母股份有限公司;吐溫80 生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂、硫酸錳 西隴化工股份有限公司;納米碳酸鈣 江西永發(fā)化工公司;海藻酸鈉 青島明月海藻集團(tuán)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-50KBS立升手輪型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安儀表有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;L204電子天平、pH計(jì)FE20 梅特勒-托利多儀器(上海)股份有限公司;5 L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司;H2500R臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Scientz-10N臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;BX43生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 MRS 培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸銨2.0 g、K2HPO4·7H2O 2.0 g、NaAc·3H2O 4.0 g,Tween 80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.60 g、MnSO4·H2O 0.25 g,將上述成分加入到1000 mL 蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH為6.2,121 ℃滅菌15 min,需要時(shí)加入15 g 瓊脂,用于活化菌種和種子培養(yǎng)以及活菌含量檢測(cè)。包被發(fā)酵培養(yǎng)基:在MRS培養(yǎng)基上添加海藻酸鈉 10 g、納米碳酸鈣20 g。

1.2.2 液體種子培養(yǎng) 將本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種糞腸球菌EXW27在培養(yǎng)基上劃線接種至斜面MRS培養(yǎng)基上活化,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,傳代兩次。從保藏斜面挑一環(huán)菌苔接于裝有100 mL液體MRS培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h。

1.2.3 包被發(fā)酵培養(yǎng) 將菌株種子液按3%(V/V)接種于裝液量為70%的5 L小罐基礎(chǔ)包被發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始pH7.0,攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min,不通氣,控制發(fā)酵溫度37 ℃至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察 用活細(xì)胞核酸染色劑(SYTO9)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的糞腸球菌進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下通過(guò)顏色不同判斷細(xì)胞的活力狀態(tài)。

1.2.5 包被培養(yǎng)糞腸球菌培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

1.2.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸銨、K2HPO4·7H2O、NaAc·3H2O,Tween 80、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、海藻酸鈉、納米碳酸鈣等12個(gè)對(duì)包被培養(yǎng)活菌含量影響較大的因素,通過(guò)Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行N=16的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1),以包被培養(yǎng)活菌含量(R)作為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)分析,從中篩選出對(duì)包被培養(yǎng)活菌含量影響顯著的培養(yǎng)基組分。

表1 二水平部分因子設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels of two-level partial factorial design

1.2.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程中各顯著性因素對(duì)響應(yīng)值的影響,以實(shí)驗(yàn)值變化梯度方向?yàn)榕榔路较?根據(jù)各因素效應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng),設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)(表5),快速逼近包被培養(yǎng)活菌含量最大區(qū)域。

1.2.5.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素,以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn),運(yùn)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)了3因素5水平共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),因素水平表見(jiàn)表2。

表2 中心組合試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Central Composite Design

1.2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 將菌株種子液按3%(V/V)接種于裝液量為70%的5 L發(fā)酵罐微囊包被培養(yǎng)最適培養(yǎng)基中,初始pH6.5,攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min,不通氣,37 ℃培養(yǎng),每隔1 h取樣。每次取樣測(cè)其活菌濃度、發(fā)酵液pH,并以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 微膠包被活菌數(shù)的測(cè)定 將樣品加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.2)中攪拌30 min,使微囊包被的糞腸球菌破壁后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù);用梯度稀釋法稀釋一定倍數(shù)后,取3個(gè)濃度梯度進(jìn)行MRS培養(yǎng)基傾注平板,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行,37 ℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù),結(jié)果以CFU/mL或CFU/g表示。

1.2.7 包被培養(yǎng)糞腸球菌的貯存耐受性試驗(yàn) 將菌液8000×g離心15 min,棄去上清液,收集菌泥;離心所得的菌泥與含3%脫脂奶粉的0.2 mol/L檸檬酸溶液等質(zhì)量混合均勻,置于-40 ℃預(yù)凍處理5 h以上,在冷凝溫度<-60 ℃、真空度<15 Pa下冷凍干燥[22]。包被培養(yǎng)和游離培養(yǎng)的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存,分別于0、10、30、60、90 d取樣,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算每克產(chǎn)品的活菌數(shù),按照公式(1)計(jì)算不同培養(yǎng)方式下糞腸球菌凍干粉在貯存不同時(shí)間的存活率。

存活率(%)=(貯存不同時(shí)間后凍干粉活菌數(shù)/初始活菌數(shù))×100

式(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所用到的數(shù)據(jù)分析軟件為Design Expert 8.0.6b及SPSS Statistics 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被培養(yǎng)和未包被培養(yǎng)的糞腸球菌形態(tài)的比較

游離培養(yǎng)和包被培養(yǎng)的糞腸球菌鏡檢結(jié)果如圖1所示。以MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的糞腸球菌EXW27細(xì)胞呈短鏈狀,均勻分散游離在發(fā)酵液中,不聚團(tuán)(圖1A),以發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的糞腸球菌EXW27細(xì)胞聚集成團(tuán)的形成微膠囊,囊內(nèi)菌體密度較大,未出現(xiàn)破囊現(xiàn)象,菌體也沒(méi)有明顯泄漏,且所形成的微囊大小較均勻,成球形良好,界限明顯(圖1B)。這是因?yàn)?在含納米碳酸鈣和海藻酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中,隨著糞腸球菌的不斷生長(zhǎng)繁殖,產(chǎn)生了大量酸性代謝產(chǎn)物(如乳酸),被納米碳酸鈣中和并釋放Ca2+,當(dāng)Ca2+向周圍擴(kuò)散形成以海藻酸鈣為主要成分凝膠薄膜,包裹于四周逐漸形成中空的球狀微囊,糞腸球菌被固定在微囊之中,從而形成微囊包被培養(yǎng)糞腸球菌。以上結(jié)果說(shuō)明,加入納米碳酸鈣和海藻酸鈣后可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糞腸球菌進(jìn)行包被培養(yǎng)。

圖1 游離培養(yǎng)和包被培養(yǎng)的糞腸球菌鏡檢結(jié)果(×100)Fig.1 Microscopy results of Enterococcus faecalisin free and encapsulated cultures(×100)注:A:在MRS培養(yǎng)基中游離培養(yǎng)的糞腸球菌;B:在發(fā)酵培養(yǎng)基中包被培養(yǎng)的糞腸球菌。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)及其結(jié)果分析

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Experimental design and response of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析Table 4 ANOVA for the Plackett-Burman design

注:“*”表示對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知,隨著葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣3個(gè)主要影響因素的變化,微囊包被活菌含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),其中第4組培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的微囊包被活菌含量達(dá)到了最大值,達(dá)到57.825×108CFU/mL,相應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域,所以選取第4組條件即葡萄糖 5.0%、海藻酸鈉1.6%和納米碳酸鈣3.2%為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)確定了主要影響因素的具體濃度的取值區(qū)間,以葡萄糖(X1)、海藻酸鈉(X2)、納米碳酸鈣(X3)3個(gè)因素為自變量,糞腸球菌微囊包被培養(yǎng)活菌含量(R)為響應(yīng)值,通過(guò)Design-expert 軟件設(shè)計(jì)3因素5水平的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表6所示。

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Results of variance analysis of response surface experiments

注:*表示差異顯著,P<0.05:**表示差異極顯著,P<0.01。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of central composite experiment

固定其中的一個(gè)因素,做另外兩個(gè)因素交互作用的曲面圖及等高線圖,確定葡萄糖濃度、海藻酸鈉濃度和納米碳酸鈣交互作用對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)含量的影響,結(jié)果如圖2。由圖2可知,葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣兩兩交互作用的等高線圖均呈橢圓形,說(shuō)明其交互作用均顯著。響應(yīng)面圖均為拋物面,都存在一個(gè)極大值點(diǎn),只有在各因素濃度適宜的條件下,培養(yǎng)后糞腸球菌微囊包被培養(yǎng)的活菌含量才會(huì)達(dá)到最大值。

圖2 各因素交互作用對(duì)糞腸球菌微囊包被培養(yǎng)的活菌含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plot and contour line ofinteractive effects of various factors onenveloped Enterococcus faecalis concentration

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

如圖2所示,響應(yīng)面拋物線圖形開(kāi)口均向下,說(shuō)明存在最大值,即響應(yīng)面覆蓋了最大值所在的區(qū)域。對(duì)回歸方程求解最大值可得:當(dāng)X1=-0.071、X2=0.897、X3=0.945,即葡萄糖為4.93%、海藻酸鈉為1.87%、納米碳酸鈣為3.65%。由此可知,最適培養(yǎng)基組成為:葡萄糖4.93%、蛋白胨1%、牛肉膏0.8%、酵母粉0.3%、檸檬酸銨0.3%、K2HPO4·7H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.06%、MnSO4·H2O 0.045%、NaAc·3H2O 0.6%、吐溫80 0.1%、海藻酸鈉 1.87%、納米碳酸鈣 3.65%。在此條件下,糞腸球菌微囊包被培養(yǎng)的預(yù)測(cè)活菌含量最大,為6.56×109CFU/mL。

最適培養(yǎng)基條件下菌株的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。由圖3可知,優(yōu)化后培養(yǎng)基在包被培養(yǎng)過(guò)程中pH緩慢下降,下降速率顯著低于優(yōu)化前(P<0.05),培養(yǎng)20 h后pH仍保持在5.8以上,為糞腸球菌包被培養(yǎng)提供較穩(wěn)定的pH環(huán)境;包被培養(yǎng)的糞腸球菌優(yōu)化后培養(yǎng)基比優(yōu)化前提前2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體的生長(zhǎng)速率明顯高于優(yōu)化前,在11 h時(shí)包被培養(yǎng)的活菌含量最高為6.83×109CFU/mL,與預(yù)測(cè)值誤差僅4.12%,說(shuō)明該模型能很好地模擬和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證實(shí)了模型的有效性。

圖3 包被培養(yǎng)的糞腸球菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Enterococcus faecalisin encapsulated culture

2.6 包被培養(yǎng)的糞腸球菌凍干粉的貯存穩(wěn)定性

由圖4可知,游離培養(yǎng)得到的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存,活菌數(shù)急速下降,在10 d存活率降至1.2%;而包被培養(yǎng)得到的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存10 d內(nèi)活菌數(shù)沒(méi)有明顯下降,90 d后存活率為82.3%,說(shuō)明包被發(fā)酵糞腸球菌凍干粉具有很好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的貨架期,這為今后糞腸球菌包被發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖4 凍干菌粉在37 ℃條件下的貯存試驗(yàn)Fig.4 Results of freeze-dried bacteriapowder accelerated storage test at 37 ℃

3 結(jié)論

形態(tài)觀察結(jié)果表明,在含納米碳酸鈣和海藻酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中,隨著糞腸球菌繁殖產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物與納米碳酸鈣和海藻酸鈉反應(yīng),形成以海藻酸鈣為主的凝膠薄膜將糞腸球菌固定在微囊之中,囊內(nèi)充滿大量菌體細(xì)胞聚集成團(tuán),微囊大小較均勻,成球形良好,界限明顯。通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣 3 個(gè)對(duì)糞腸球菌包被培養(yǎng)活菌含量影響顯著(P<0.05)。進(jìn)一步優(yōu)化得到的包被發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成為:葡萄糖4.93%、海藻酸鈉1.87%、納米碳酸鈣3.65%。對(duì)包被培養(yǎng)優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn),整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中pH維持在5.8以上,包被培養(yǎng)的糞腸球菌活菌達(dá)6.83×109CFU/mL,與預(yù)測(cè)值誤差僅4.12%,是優(yōu)化前的2.88倍。在糞腸球菌凍干粉的貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),包被培養(yǎng)的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存10 d內(nèi)活菌數(shù)沒(méi)有明顯的下降,90 d后活菌仍保留80%以上的存活率,說(shuō)明包被培養(yǎng)糞腸球菌凍干粉具有較高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的貨架期,為糞腸球菌微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。