基于TGF-β1/p38MAPK通路探討益血降濁湯對UUO大鼠腎纖維化的作用機制

楊少寧 周錦紋 陳丹倩 陳淋 毛加榮 于小勇

摘要：目的探討益血降濁湯對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）大鼠腎纖維化的作用及TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)蛋白的影響，闡明其作用可能的機制。方法建立UUO大鼠模型，將42只大鼠隨機平均分為假手術(shù)組、UUO組、UUO+依那普利組、UUO+益血降濁湯低、中和高劑量組。于2周后處死，記錄尿量、體重數(shù)據(jù)，采集血液檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標MDA、ROS和SOD含量。并取腎組織，Masson染色觀察腎組織病理改變;免疫組織化學(xué)染色檢測COX-2、Collagen I和p-p38MAPK表達情況;蛋白免疫印跡檢測炎癥、細胞外基質(zhì)（ECM）以及TGFβ1/p38MAPK通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果與UUO組相比，益血降濁湯（低、中、高）均能逆轉(zhuǎn)大鼠尿量和體重的下降;降低ROS和MDA的水平，促進SOD的增加;減輕腎組織病理改變;下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白的表達，使抗炎因子的表達增加;減少ECM的沉積;抑制TGF-β1/P38MAPK通路活性;其中，高劑量組效果最為顯著。結(jié)論益血降濁湯可能通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK通路活性改善炎癥和氧化應(yīng)激、抑制腎纖維化來發(fā)揮腎保護作用。

關(guān)鍵詞：益血降濁湯;炎癥;氧化應(yīng)激;細胞外基質(zhì);TGF-β1/p38MAPK通路;腎纖維化

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2019）10-0060-08

Study on the Mechanism of Yixue Jiangzhuo Decoction on Renal Fibrosis

in UUO Rats Based on TGF-β1/p38MAPK Pathway

YANG Shao-ning1，ZHOU Jin-wen1，CHEN Dan-qian2，CHEN Lin2，MAO Jia-rong1，YU Xiao-yong1

（1.?Department of Nephrology，Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xian 710003，China;

2.?College of Life Science，Northwest University，Xian 710069，China）

【Abstract】Objective： To study the effects of Yixue Jiangzhuo Decoction on renal fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction（UUO）and the related proteins of TGF-β1/p38MAPK pathway，and to elucidate its possible mechanism.?Methods： A UUO rat model was established.?42 rats were randomly divided into sham operation group，UUO group，UUO+enalapril group，and low，medium and high dose groups of UUO+Yixue Jiangzhuo Decoction.?After 2 weeks，the rats were sacrificed，and their urine volume and body weight data were recorded and their blood was taken to detect the content of related indicators MDA，ROS and SOD for oxidative stress.?Their renal tissue was taken to observe the pathological changes of renal tissues by Masson staining.?The expressions of COX-2，Collagen I and p-p38MAPK were detected by immunohistochemical staining.?Inflammation，extracellular matrix（ECM）and TGFβ1/p38MAPK pathway-related proteins were detected by western blotting.?Results： Compared with the UUO group，Yixue Jiangzhuo Decoction（low，medium and high doses）can reverse the decrease of urine volume and body weight in rats，reduce the levels of ROS and MDA，promote the increase of SOD and relieve the pathological changes of renal tissues.?It also down-regulated the expression of inflammation-related proteins，increased the expression of anti-inflammatory factors，decreased the deposition of ECM and inhibited the activity of TGF-β1/P38MAPK pathway.?Among them，the high-dose group was the most effective.?Conclusion： Yixue Jiangzhuo Decoction may play a role in renal protection by regulating the activity of TGF-β1/p38MAPK pathway to improve inflammation and oxidative stress and inhibit renal fibrosis.

【Key words】Yixue Jiangzhuo Decoction，inflammation，oxidative stress，extracellular matrix，TGF-β1/p38MAPK pathway，renal fibrosis

腎小管間質(zhì)纖維化被認為是所有慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展為腎功能衰竭的共同途徑。其病理演變是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，主要包括炎性細胞浸潤、成纖維細胞的活化、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積以及腎小管萎縮和微血管稀疏[1]。其中，炎癥和氧化應(yīng)激是腎纖維化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)[2];同時，大量的ECM沉積被認為是腎纖維化形成的關(guān)鍵[2];此外，該過程還涉及多種細胞因子和信號通路，TGFβ1/p38MAPK通路便是其中關(guān)鍵的一條，其能調(diào)控多種靶基因，在腎纖維化的進展過程中發(fā)揮重要作用[3];而任何這些病理改變都能以其特有的方式促進腎小管間質(zhì)纖維化的進展，并最終導(dǎo)致腎功能的喪失[5]。因此，靶向調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵因素是減輕纖維化的重要策略。目前腎纖維化的治療主要是通過控制血壓、抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)和對癥治療為主[6]。值得注意的是，已經(jīng)有最新研究指出，中藥復(fù)方在減緩CKD早期患者腎纖維化過程中發(fā)揮著有益作用[7-9]。益血降濁湯是本科根據(jù)臨床經(jīng)驗總結(jié)的協(xié)定方，多年來應(yīng)用于CKD的防治，已取得了良好的臨床療效，筆者前期的研究已經(jīng)證實，益血降濁湯能緩解CKD患者的臨床癥狀、糾正貧血、調(diào)節(jié)血脂、減輕高凝和微炎癥狀態(tài)以及改善腎功能的作用[10-12]，但其作用機制尚未闡明。因此，本實驗以單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠為研究對象，觀察益血降濁湯對UUO大鼠炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化的影響以及TGF-β/p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況，進而探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1動物健康雄性SD大鼠42只，體重（200±20）g，購于西安交通大學(xué)動物實驗中心。動物實驗方案經(jīng)西北大學(xué)動物使用委員會批準，在西北大學(xué)動物實驗中心喂養(yǎng)，所有大鼠給予標準飼料，并自由飲水。

1.2藥物與主要試劑益血降濁湯免煎顆粒配方（黃芪30 g，生地、丹參各20 g，山茱萸、淫羊藿、莪術(shù)、制首烏、澤蘭、川芎各15 g，生大黃6 g），馬來酸依那普利片（規(guī)格10 mg，亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字H14023578）購于陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科;主要試劑：NF-kB、MCP-1、COX-2、Nrf2、HO-1、α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin、Fibronectin、TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、ASK-1、p-MKK3/6和p-ATF2（美國Abcam公司）。

1.3主要儀器病理切片機（RM2016，德國Leica公司）;光學(xué)顯微鏡（CX31，日本OLYMPUS公司）;垂直電泳槽（VE180，上海天能科技有限公司）;轉(zhuǎn)移電泳槽（VE-186，上海天能科技有限公司）;全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon 6100，上海天能科技有限公司）。

1.4動物分組和給藥將42只大鼠隨機分成6組（n=7）：假手術(shù)組和UUO組以等容量（2 mL/100 g）的蒸餾水灌胃;UUO+依那普利組用馬來酸依那普利片按成人等效劑量1.05 mg/kg灌胃;UUO+益血降濁湯低、中、高劑量組（分別予益血降濁湯免煎顆粒1.418 g/kg，2.835 g/kg，5.670 g/kg灌胃），各組按以上方案灌胃，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.5造模使用200±20 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，于左側(cè)背部肋下約0.5cm處切口，縱向逐層切開皮膚肌層至腹腔，游離左側(cè)腎臟及輸尿管，以4-0無損傷絲線兩次結(jié)扎左側(cè)輸尿管，制備UUO模型。逐層縫合，送回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠的輸尿管暴露，但未結(jié)扎。

1.6取材6組大鼠于手術(shù)后2周處死。留取處死前一天24 h尿量。各組大鼠稱重后，予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，頸動脈取血后立即脫頸處死，解剖后迅速分離左腎，分為2份，一份浸泡于10%甲醛中固定，腎臟組織脫水后用蠟塊包埋，并制作石蠟切片用于Masson和IHC染色;另一份于液氮中凍存用于Western Blot檢測。

1.7方法及檢測指標

1.7.1體重與尿量每日測大鼠體重，并于處死前一天留取大鼠24 h尿量。

1.7.2氧化應(yīng)激相關(guān)指標的檢測于大鼠頸總動脈取血后送檢于上海遠慕生物科技有限公司，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測MDA、SOD和ROS含量。

1.7.3Masson染色取腎臟組織標本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，并制成5μm石蠟切片，按照常規(guī)方法行Masson染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。使用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析。

1.7.4免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）觀察腎臟組織中COX-2、Collagen I和p-p38MAPK表達情況。常規(guī)制備5μm石蠟包埋的大鼠腎組織切片，烤片后經(jīng)過3次二甲苯脫蠟水化，分別用甲醇和蒸餾水洗滌。向切片加入3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。通過微波在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中進行抗原修復(fù)15 min。滴加5%山羊血清封閉液于濕盒中孵育15 min，滴加一抗，4℃過夜。次晨洗片后加用二抗孵育（37℃、40 min），DAB顯色（室溫，鏡下控制反應(yīng)時間），蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水洗滌、氨水反藍、透化、中性樹膠封片，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。

1.7.5蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）檢測UUO大鼠腎組織中與炎癥、ECM以及TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況 將60mg腎臟組織剪碎，磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗，離心后加裂解液，勻漿，再離心取上清（即總蛋白），提取蛋白后，用BCA法測定蛋白濃度，通過Tris-甘氨酸溶解凝膠分離20-30μg總蛋白，并轉(zhuǎn)移至0.45μm PVDF膜上。在5%脫脂奶粉封閉緩沖液中溫育1 后，將膜在4℃下與第一抗體一起溫育過夜。次日洗滌后滴加二抗，于搖床上室溫孵育1h，取出PVDF膜，顯色液顯色，全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描光密度，使用Image J軟件測定各蛋白的相對光密度值，以α-微管蛋白（α-tubulin）為參照。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1益血降濁湯對UUO大鼠體重與尿量的影響通過分析大鼠體重和尿量的數(shù)據(jù)，筆者觀察到，UUO模型大鼠的體重和尿量較假手術(shù)組明顯下降，而益血降濁湯（低、中、高）和依那普利均能逆轉(zhuǎn)體重和尿量的減少。值得注意的是，UUO大鼠體重和尿量的增長與益血降濁湯的劑量呈正相關(guān)，且高劑量的益血降濁湯效果最顯著。但高劑量的益血降濁湯和依那普利相比，并未顯示出明顯差異（圖1?A、B）。

2.2益血降濁湯對UUO大鼠腎組織病理改變的影響在Masson染色中，假手術(shù)組大鼠腎臟未見明顯組織形態(tài)學(xué)異常，而UUO模型大鼠的腎臟顯示出嚴重的腎小管擴張、管腔形態(tài)不規(guī)則、腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、肌成纖維廣泛表達（紅色）和點片狀膠原纖維沉積（藍紫色）。通過益血降濁湯（低、中、高）和依那普利治療后，上述病理改變明顯減輕，其中尤以益血降濁湯高劑量組最為顯著。并且其作用與依那普利相似（圖1?C）。

（A）體重相對定量數(shù)據(jù);（B）尿量相對定量數(shù)據(jù);（C）各組大鼠腎組織Masson染色代表性顯微照片，顯示各組大鼠腎臟炎癥和纖維化病變（放大倍數(shù)：×200）。與假手術(shù)組（n=7）相比，*P<0.05，**P<0.01。與UUO組（n=7）相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3益血降濁湯對大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響檢測結(jié)果表明：與假手術(shù)組比較，UUO導(dǎo)致大鼠ROS、MDA水平顯著升高，SOD活性明顯降低。與UUO模型組相比，益血降濁湯（低、中、高）和依那普利均能促進大鼠血液中SOD含量的增加并降低ROS和MDA的水平。雖然益血降濁湯（高）升高SOD的效果優(yōu)于依那普利，但在降低ROS和MDA方面并沒有顯著差異（圖2?A、B和C）。

2.4益血降濁湯對UUO大鼠腎組織炎癥相關(guān)蛋白的影響IHC結(jié)果表明：假手術(shù)組未見COX-2明顯表達，而UUO組可見COX-2在腎小管大量堆積且排列紊亂（棕黃色），當(dāng)給予益血降濁湯高劑量和依那普利治療后，COX-2的表達減弱（圖2?D）。因益血降濁湯（低、中）組變化不明顯，故未列出。類似的Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，UUO模型組大鼠NF-κB、MCP-1、COX-2的表達明顯升高，Nrf2、HO-1的表達顯著減低;相比于UUO組，通過益血降濁湯（低、中、高）以及依那普利治療后，能減弱NF-κB、MCP-1、COX-2的表達，并增加Nrf2及其靶基因HO-1的表達。特別是益血降濁湯高劑量變化最為顯著，其抗炎作用優(yōu)于依那普利且與劑量呈正相關(guān)（圖2?E、F）。

2.5益血降濁湯對UUO大鼠腎組織ECM相關(guān)蛋白的影響與假手術(shù)組相比，UUO組大鼠α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin和Fibronectin蛋白的表達明顯升高;相比于UUO組，益血降濁湯（低、中、高）和依那普利治療后，可抑制UUO大鼠α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin和Fibronectin的上調(diào)。值得注意的是，益血降濁湯高劑量組顯示出與依那普利相似的抑制ECM沉積的作用（

圖3?A、B）。類似的IHC染色結(jié)果顯示，UUO模型中Collagen I在腎間質(zhì)區(qū)域廣泛沉積（棕黃色），當(dāng)給予益血降濁湯和依那普利治療后，能減少Collagen I表達，且高劑量的益血降濁湯與依那普利作用相似（圖3?C）。因益血降濁湯（低、中）組變化不明顯，故未列出。

2.6益血降濁湯對UUO大鼠TGFβ1/p38MAPK通路相關(guān)蛋白的影響與假手術(shù)組相比，UUO組大鼠TGF-β1、ASK-1、p-MKK3/6、p38MAPK、p-p38MAPK、p-ATF2蛋白的表達明顯升高;相比于UUO組，使用益血降濁湯（低、中、高）和依那普利治療后，能下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的ASK-1和p38MAPK表達，降低MKK3/6、p38MAPK和ATF2磷酸化水平，其中益血降濁湯高劑量組下降最為明顯，且與用藥劑量呈正相關(guān)（圖4 A、B、C、D）。同時，筆者在免疫組織化學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)，UUO組中p-p38MAPK陽性蛋白于細胞核中活躍表達。而通過益血降濁湯高劑量和依那普利治療后，p38MAPK的磷酸化表達明顯減弱，且高劑量的益血降濁湯與依那普利作用相似（圖4 E）。因益血降濁湯（低、中）組變化不明顯，故未列出。

3討論

炎癥在CKD發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色[13]。炎癥因子可刺激腎臟損傷部位的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，從而誘導(dǎo)ECM的產(chǎn)生和沉積，促進腎小管間質(zhì)纖維化[14]。許多促炎細胞因子均受NF-κB調(diào)控，在炎癥反應(yīng)期間，游離的NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)移到細胞核以轉(zhuǎn)錄促炎因子[15]，NF-κB的激活伴隨著炎癥因子的上調(diào)和抗氧化系統(tǒng)的下調(diào)[16];MCP-1能調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞的募集和分化[17]，是導(dǎo)致炎癥細胞浸潤到腎臟中的主要分子[18]，在腎病的進展中發(fā)揮致病作用;COX-2作為介導(dǎo)炎癥的重要蛋白之一，在受到應(yīng)激時大量表達。通過抑制這些炎癥反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達是目前治療CKD最有吸引力的靶點[19]。細胞保護因子Nrf2和HO-1在改善炎癥等方面發(fā)揮有益作用[20]。Nrf2是抗炎、抗纖維化的關(guān)鍵因子[21];Nrf2的激活決定抗氧化因子HO-1的合成，同時HO-1能夠保護細胞免受氧化損傷，降解游離血紅素和抑制ROS產(chǎn)生[22]。已經(jīng)有研究報道，協(xié)同上調(diào)Nrf2和HO-1的表達水平可以保護細胞免受氧化和凋亡的損害[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，IHC染色觀察到COX-2在UUO組中大量表達，當(dāng)給予血降濁湯治療后，COX-2的沉積明顯減少。Western Blot檢測出腎組織中NF-κB、MCP-1、COX-2的表達較UUO組明顯降低、細胞保護因子Nrf2、HO-1的表達顯著提高。這些結(jié)果提示，益血降濁湯能夠減少促炎因子表達和增加抗炎因子的釋放，從而減輕腎損傷。

氧化應(yīng)激是由ROS產(chǎn)生和清除之間的不平衡引起的，同時，ROS能誘導(dǎo)許多異常信號傳導(dǎo)途徑，如炎性細胞浸潤等[23]，在CKD中起關(guān)鍵作用[24]。氧化應(yīng)激作為一種誘導(dǎo)細胞凋亡的初始信號[25]，在生理條件下，引起抗氧化和細胞保護蛋白上調(diào)，以防止功能障礙和腎損傷;病理狀態(tài)下，氧化應(yīng)激通過多種途徑觸發(fā)炎癥，而炎癥主要通過細胞產(chǎn)生活性氧而造成氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激和炎癥相互作用，形成惡性循環(huán)，加重腎損傷[16]。MDA作為一種生理性酮醛，由不飽和脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)生，是花生四烯酸代謝的副產(chǎn)物，MDA水平的高低一定程度上反應(yīng)了氧化應(yīng)激引起的細胞損傷程度[26]。而SOD被認為是一種具有保護細胞功能的抗氧化酶，可以使機體免受各種損傷的侵害。研究發(fā)現(xiàn)，SOD含量的增加，能使ROS、MDA和細胞凋亡減少[27]。因此，本實驗研究選取ROS、MDA和SOD作為檢查氧化應(yīng)激的相關(guān)指標。結(jié)果顯示，高劑量的益血降濁湯能顯著增加大鼠血液中SOD的含量，并降低ROS和MDA含量。提示益血降濁湯可能通過減少ROS和MDA的產(chǎn)生，同時增加抗氧化物SOD的活性參與腎保護。

腎纖維化的主要特征在于腎小管和腎小管周圍毛細血管之間的區(qū)域病理性纖維狀基質(zhì)的沉積。在病理條件下，腎小管上皮細胞可能會分化成間充質(zhì)細胞和活化的成纖維細胞，通過趨化因子最終形成肌成纖維細胞，該過程被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）[28]，EMT是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要機制，在EMT過程中，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin和Fibronectin蛋白的表達均增加[29]，這些蛋白同樣是ECM的重要組成成分。α-SMA是肌成纖維細胞的特征性標志蛋白，也是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的關(guān)鍵[30]。在ECM中Collagen I、Collagen Ⅲ提供主要的結(jié)構(gòu)支撐，其表達量的多少在一定程度上反應(yīng)了腎間質(zhì)纖維化的程度。中間絲家族蛋白Vimentin，主要表達于間充質(zhì)細胞中，作為細胞的骨架結(jié)構(gòu)在炎癥和多種自身免疫系統(tǒng)疾病中起作用[31]。Fibronectin也是ECM的關(guān)鍵成分，能夠整合蛋白受體以及形成ECM結(jié)構(gòu)成分之間所必需的連接，更是許多其他ECM蛋白沉積的基礎(chǔ)[32]。因此本實驗綜合檢測這些關(guān)鍵蛋白，能更好的反應(yīng)腎纖維化的變化情況。本研究發(fā)現(xiàn)，通過益血降濁湯治療后，IHC和Masson染色結(jié)果顯示，有效的減輕了Collagen I的表達以及腎臟組織病理學(xué)改變。同樣的結(jié)果也在Western Blot檢測中得到證實，大鼠腎組織中α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin和Fibronectin的表達均較UUO組下降。提示益血降濁湯在一定程度能夠通過阻斷ECM的過表達而改善腎纖維化。

TGFβ1/p38MAPK信號通路響應(yīng)各種炎癥、氧化應(yīng)激和其他刺激而被激活，在腎纖維化過程中起關(guān)鍵作用。而抑制該通路的活性能夠減緩腎纖維化的進展[3]。TGF-β1、ASK-1、p-MKK3/6、p38MAPK、p-p38MAPK和p-ATF2是該通路上關(guān)鍵的蛋白分子。TGF-β1在受到各種刺激后被激活，進一步影響下游因子ASK-1的活化，ASK-1的過表達促進MKK3/6磷酸化。作為上游因子的MKK3/6是p38MAPK主要的激活劑，被激活的p38MAPK通過磷酸化產(chǎn)生p-p38MAPK，促進ATF2的磷酸化，從而產(chǎn)生一系列生物活性反應(yīng)。TGF-β1是最普遍的促纖維化細胞因子之一[33]，其最重要的生物學(xué)作用是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)，目前已經(jīng)被證實TGF-β1的增加與腎纖維化密切相關(guān)[3];ASK-1是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥和纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[34]，眾所周知，各種類型的細胞毒性應(yīng)激物通過產(chǎn)生過量的ROS激活A(yù)SK-1，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[35];MKK3/6、p38MAPK以及ATF2具有非磷酸化和磷酸化兩種形式，其通過轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)進一步刺激下游底物的磷酸化，實現(xiàn)信號傳遞。因此磷酸化的蛋白更能反映真實的蛋白活性。MKK3/6是TGFβ1/p38MAPK信號通路主要信號傳導(dǎo)亞群之一，可以特異性磷酸化和激活p38MAPK，是與凋亡和炎癥密切相關(guān)的蛋白激酶[36];p38MAPK是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，過度的刺激如炎癥、氧化應(yīng)激可以激活p38MAPK導(dǎo)致細胞功能障礙[37];p-p38MAPK作為p38MAPK磷酸化的產(chǎn)物，可以進入細胞核內(nèi)，參與調(diào)控多種核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生;ATF2是DNA結(jié)合蛋白的亮氨酸拉鏈家族的成員，主要參與調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)，磷酸化的ATF2在細胞凋亡和炎癥中起關(guān)鍵作用[38]，研究表明ATF2在多種炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[39，40]。本次研究發(fā)現(xiàn)，UUO大鼠通過益血降濁湯治療2周后，該通路上TGF-β1、ASK-1和p38MAPK的活性被明顯抑制，同時MKK3/6、p38MAPK以及ATF2磷酸化水平顯著降低。提示益血降濁湯發(fā)揮腎臟保護作用的機制可能是通過抑制TGFβ1/p38MAPK通路，減少磷酸化水平產(chǎn)生的。

UUO是使用最廣泛的間質(zhì)纖維化模型，能夠迅速導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化、炎癥、腎小管和間質(zhì)細胞的凋亡，與CKD患者組織病理學(xué)變化基本一致[41]。本次研究也證實，造模成功的UUO大鼠腎臟中，其炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化相關(guān)蛋白的表達較假手術(shù)組均明顯升高，并且在不進行任何干預(yù)的條件下，其腎損傷的表現(xiàn)并未顯示出緩解趨勢。

中藥在臨床中廣泛使用，并被認為是預(yù)防和治療各種腎病的有效療法[43]。越來越多的證據(jù)表明，單味中藥[44-46]以及中藥復(fù)方[47]中提取的許多化合物能通過多種途徑來延緩CKD的進展。本次研究發(fā)現(xiàn)，益血降濁湯能逆轉(zhuǎn)UUO大鼠尿量和體重的下降;降低ROS和MDA的水平，促進SOD的增加;Masson染色顯示，經(jīng)治療后腎組織病理改變減輕;IHC染色顯示，Cox-2、Collagen I和p-p38MAPK的表達在治療后明顯減少，這與Western Blot的結(jié)果相一致;Western Blot結(jié)果表明，經(jīng)益血降濁湯治療后Nf-κB，MCP-1、COX-2和α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin以及TGF-β1、ASK-1、p38MAPK、PMKK3/6、p-p38MAPK、p-ATF2的表達明顯降低，而Nrf2和HO-1的表達顯著增加。并且其作用與劑量呈正相關(guān)。以上結(jié)果均證實益血降濁湯對受損的腎組織具有修復(fù)作用。因此筆者推測，益血降濁湯腎保護的作用可能是多靶點的，通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK通路活性來改善炎癥和氧化應(yīng)激、減少ECM的沉積，抑制腎纖維化來發(fā)揮腎保護作用。綜上所述，益血降濁湯可能是有希望的具有潛在抗炎、抗氧化、抗纖維化的中藥復(fù)方，也為益血降濁湯后期深入研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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