益血降濁湯對TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞α-SMA表達的影響

王悅彤 徐薇 李現(xiàn)成 張楠 屈凱 于小勇

摘要：目的探討益血降濁湯對轉化生長因子（TGF-β1）誘導的腎小管上皮細胞α-SMA表達及抗腎間質纖維化的影響。方法通過體外培養(yǎng)建立腎小管上皮細胞模型。分為空白組、轉分化組、益血降濁湯組（實驗組）和海昆腎喜膠囊組（對照組），通過免疫細胞化學法（SABC 法）檢測后在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長，以及觀察各組細胞TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達。應用MTT比色法探索腎成纖維細胞的增殖情況，繼而探討益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響。結果益血降濁湯能下調(diào)α-SMA的表達，對比TGF-β1組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論益血降濁湯通過下調(diào)α-SMA緩解腎間質纖維化。

關鍵詞：腎小管上皮細胞;益血降濁湯;TGF-β1;α-SMA;腎間質纖維化

中圖分類號：R285.6文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2019）10-0068-05

Effect of Yixue Jiangzhuo Decoction on Expression of α-SMA in Renal Tubular

Epithelial Cells Induced by TGF-β1

WANG Yue-xi1，XU Wei2，LI Xian-cheng2，ZHANG Nan2，QU Kai2，YU Xiao-yong2

（1.?Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，China;

2.?Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xian 710003，China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Yixue Jiangzhuo Decoction on expression of α-SMA and anti-renal interstitial fibrosis induced by transforming growth factor（TGF-β1）in renal tubular epithelial cells.?Methods： Tubular epithelial cell models were established by in vitro culture and divided into blank group，transdifferentiation group，Yixue Jiangzhuo Decoction group（experimental group）and Haikun Shenxi capsule group（control group）.?The cell form and growth as well as expression of TGF-β1 and α-smooth muscle actin（α-SMA）in each group were observed by immunocytochemistry（SABC method）under the inverted microscope.?The proliferation of renal fibroblasts was observed by MTT colorimetric method and then the effect of Yixue Jiangzhuo Decoction on the proliferation of kidney fibroblasts cultured in vitro was studied.?Results： Yixue Jiangzhuo Decoction could down-regulate the expression of α-SMA，compared with TGF-β1 group，and the difference was statistically significant（P<0.05）.?Conclusion： Yixue Jiangzhuo Decoction relieves renal interstitial fibrosis by down-regulating α-SMA.

【Key words】 renal tubular epithelial cells，Yixue Jiangzhuo Decoction，TGF-β1，α-SMA，renal interstitial fibrosis

腎臟是維持機體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定的重要器官。腎成纖維細胞通常不分布在正常的腎臟組織中。當腎臟受到創(chuàng)傷或者處于炎癥狀態(tài)時，腎內(nèi)轉化生長因子（例如TGF-β1）等的分泌增加可能導致腎小管上皮細胞的極性喪失，細胞內(nèi)緊密連接消失，細胞間粘連減少，導致腎小管上皮細胞向腎成纖維細胞的轉化，轉化后的腎成纖維細胞有成纖維細胞、間充質細胞和平滑肌細胞三大特性，可以表達多種標志蛋白，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。轉化后的成纖維細胞又可上調(diào)轉化生長因子（如TGF-β1）的表達，進一步的加重腎臟病理改變[1-4]。益血降濁湯的組方為[5]（黃芪30 g，生地20 g，丹參20 g，山茱萸15 g，制首烏15 g，淫羊藿15 g，川芎15 g，莪術15 g，澤蘭15 g，生大黃6 g）在本院腎病科長期的臨床用藥的過程中發(fā)現(xiàn)對其慢性腎臟病具有較好的臨床療效[6～7]，在此它可以通過抑制和下調(diào)腎成纖維細胞中TGF-β1的表達來拮抗腎成纖維細胞不良增殖，從而抑制腎成纖維細胞的產(chǎn)生和發(fā)展。通過探究其中的作用機制和進一步觀察腎小管上皮細胞的TGF-β1、α-SMA表達[8～10]，本文通過觀察腎小管上皮細胞的TGF-β1、α-SMA表達，探究實益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖作用的影響?，F(xiàn)將實驗結果報道如下。

1實驗材料

1.1實驗細胞

1.1.1從正常的Wistar大鼠腎皮質中培養(yǎng)獲得腎小管上皮細胞

1.1.2從正常的Wistar大鼠腎髓質中培養(yǎng)獲得腎成纖維細胞

1.2試劑及耗材胎牛血清（杭 州 四 季 青），DMEM-F12培養(yǎng)基，Ⅰ型膠原酶（美國 Sigma），胰酶消化液，兔抗人角蛋白CK18（Bioss），SABC免疫組化染色試劑盒（博士德生物），DAB顯色試劑盒（博士德生物）、MTT（Sigm美國）、胰蛋白酶（Ameresco美國）、PMSF（北京鼎國生物科技有限公司）、青鏈霉素 、Tris（西安輝瑞生物科技有限責任公司）。

1.3實驗儀器ST 16R（Thermo Scientific），CO2細胞培養(yǎng)箱（Therom公司），顯微鏡日本（Olympus），Centrifuge 5417R臺式冷凍離心機，Power/PAC 300電泳儀，酶標儀，移液器等。

2實驗方法

2.1腎小管上皮細胞模型的建立

2.1.1腎小管節(jié)段分離實驗前將大鼠禁食12 h并進水自由。斷尾處死，在75%乙醇中浸泡5 min。取處死大鼠腎組織并置于含有雙抗的PBS冷溶液中以除去腎蒂和包膜，剪碎，研磨腎皮質，并將取得的液體經(jīng)離心機1500 r/min離心8 min，棄上清液在沉淀中加入Ⅰ型膠原酶，分別37℃振蕩消化，1500 r/min 離心。

2.1.2腎小管上皮細胞的元代培養(yǎng)及傳代離心后的沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基并輕輕吹打混合均勻。將細胞接種到培養(yǎng)瓶中并靜置于37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后補加培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)約4～6 d，讓其細胞貼滿瓶底，用胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長規(guī)律。

2.1.3免疫細胞化學法（SABC 法）細胞爬片后，PBS輕輕沖洗。4%多聚甲醛固定60 min。試劑盒顯色，使用蘇木素輕度復染，并用中性樹膠封片。

2.2將腎小管上皮細胞分組進行免疫細胞化學觀察和TGF-β1、α-SMA的表達分析

2.2.1分組空白組、轉分化組、益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組。

2.2.2每組進行細胞爬片24 h后進行同步，然后按照上述組別培養(yǎng)24 h。取出細胞爬片，用PBS漂洗，4%多聚甲醛室溫固定20 min后進行細胞免疫化學檢測。按試劑盒說明書進行具體步驟操作。

2.3通過MTT比色法探益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響。

2.3.1分組空白組、增殖組、益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組。

2.3.2空白組在培養(yǎng)液中加入0.4 mL空白組大鼠血清，增殖組在培養(yǎng)液中加入腎臟間質纖維化模型大鼠血清和空白組大鼠血清各0.2 mL，益血降濁湯組在培養(yǎng)液中加入腎臟間質纖維化模型大鼠血清和含益血降濁湯血清各0.2 mL，海昆腎喜膠囊組在培養(yǎng)液中加入腎臟間質纖維化模型大鼠血清和含百令膠囊血清各0.2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。在48 h、72 h和96 h的培養(yǎng)中，收集培養(yǎng)孔中各組的細胞，并通過MTT比色法觀察腎成纖維細胞增殖的變化。

2.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理，數(shù)據(jù)用（平均數(shù)±標準差）表示，組間采用單因素方差分析。組間兩兩比較用LSD。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3實驗結果

3.1腎小管上皮細胞模型的建立在顯微鏡下能觀察到正常的腎小管細胞的形態(tài)大多為鵝卵石鋪路狀。排列分布較為均勻，貼壁數(shù)量較多，見圖1。

3.2分別對每組腎小管上皮細胞進行免疫細胞化學觀察、分析TGF-β1、α-SMA的表達情況倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)， 益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的腎小管上皮細胞形態(tài)學特征呈橢圓形。轉分化TGF-β1組細胞呈現(xiàn)無序的梭形外觀， 并且細胞被轉分化為腎成纖維細胞.陽性表達十分明顯，呈深棕色。益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組黃色區(qū)域變淡，而益血降濁湯組陽性表達的總面積低于海昆腎喜膠囊組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），圖2。

觀察顯微鏡下觀察在胞漿中的α-SMA表達，上圖空白組中可觀察到少量黃色陽性表達。轉分化組黃色陽性表達增多和加深，部分區(qū)域呈深褐色，陽性表達非常顯著。益血降濁湯組陽性表達面積明顯減少，相較其他組顏色變淺，與空白組相比，具有顯著差異性。益血降濁湯組α-SMA表達與海昆腎喜膠囊組α-SMA表達相比較黃色變少，如圖顏色較淺，陽性表達區(qū)域明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見圖3。

3.3統(tǒng)計學結果轉分化組腎成纖維細胞的增殖明顯高于空白組，與之比較具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的腎成纖維細胞的增殖低于轉分化組，與之相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;說明轉分化組腎成纖維細胞的增殖量增加，而益血降濁湯能降低轉分化因子的表達，見表1。

轉分化組腎小管上皮細胞中TGF-β1、α-SMA的表達顯著高于空白組，與之比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA的表達明顯低于轉分化組，與之相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;說明轉分化組腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA的表達顯著，而益血降濁湯能明顯降低腎小管上皮細胞TGF-β1、α-SMA的表達，見表2。

轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞48h增殖的影響高于空白組，與之比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響低于轉分化組，與之相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;說明轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響較大，而益血降濁湯能降低在體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞的增殖，見表3。

轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞72h增殖的影響明顯高于空白組，與之比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響低于轉分化組，與之相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;說明轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響較大，而益血降濁湯能明顯降低在體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞的增殖，見表4。

轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞96h增殖的影響顯著高于空白組，與之比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;益血降濁湯組、海昆腎喜膠囊組的益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響顯著低于轉分化組，與之相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;說明轉分化組中益血降濁湯對體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞增殖的影響較大，而益血降濁湯能明顯降低在體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞的增殖，見表5。

4討論

腎間質纖維化的產(chǎn)生和進行式發(fā)展是多種慢性腎臟病持續(xù)進展的結果。是由多種炎癥介質、轉化生長因子、細胞增殖和細胞凋亡等作用下的結局。其中它與成纖維細胞的增殖密切相關。腎間質纖維化的形成過程主要是由于腎小管上皮細胞在病理損傷、炎癥等的狀態(tài)下經(jīng)TGF-β1作用下，產(chǎn)生腎成纖維細胞，使之進一步發(fā)展，并最終積聚在細胞外基質中[11-15]。α-SMA作為肌成纖維細胞的標志蛋白，同時也是腎小管上皮細胞向間質細胞轉化過程中的標志性蛋白，它是細胞外基質合成的主要來源，又影響腎成纖維細胞、腎小管細胞等的凋亡進程。當在TGF-β1增加的過程中，α-SMA的表達增高，對腎臟的損害程度也隨之加重[16-17]。針對這一病理因素，在實驗和臨床上選用益血降濁湯進行治療取得了良好效果。黃芪在方中可以活血利濕，補中益氣，大黃通腑泄?jié)?，推陳出新，制首烏、山茱萸、淫羊藿、生地黃補氣血，益精氣，有填補腎精之功效。與丹參、川芎、澤蘭、莪術配伍可達到活血化瘀，通利排毒的目的。此方標本兼顧，使得生化有源，水濕得化。益血降濁湯能抑制轉分化的發(fā)生發(fā)展，具有拮抗α-SMA表達，同時降低TGF-β1對腎小管上皮細胞的損傷，改善腎臟纖維化的程度，對腎臟功能起到保護作用[18]。

綜上，益血降濁湯可通過降低TGF-β1和α-SMA蛋白的表達，減輕腎小管上皮細胞的損傷程度，抑制轉分化的發(fā)生，減輕腎間質纖維化，進一步證實了其在預防和治療慢性腎臟病中的重要性。

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