五味子乙素對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老的影響及機制

仲維莉，鄒國良，徐洪濤

(1黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院)

高血糖癥是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，糖尿病患者發(fā)生大血管并發(fā)癥是非糖尿病人群的2～4倍。高血糖導致的氧化應激增強是糖尿病大血管病變的發(fā)病基礎。高糖還可加速內(nèi)皮細胞衰老，而衰老所導致的血管內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化早期的關鍵環(huán)節(jié)[1]。五味子乙素為中藥北五味子主要有效成分之一，部分研究表明五味子乙素具有抗氧化應激、降糖、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用。本課題組曾構建急性高糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老模型，觀察到隨著糖濃度增加及作用時間延長，內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)顯著衰老特征，而L-精氨酸可以延緩高糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老，該作用與上調(diào)PI3K/Akt通路、增強端粒酶活性、修復氧化應激損傷有關；同時亦可促使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白磷酸化，減輕活性氧簇(ROS)造成的氧化應激損傷，進而達到抗細胞衰老的作用?；谝陨涎芯炕A，2014年6月～2017年12月，本研究觀察了不同濃度五味子乙素對高糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的抗衰老作用，并探討抗衰老作用是否與增強細胞抗氧化應激能力有關，為防治糖尿病大血管病變中藥單體的研發(fā)提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 HUVEC(C-003-5C)第3～4代，培養(yǎng)液含有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM，于培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃的細胞孵育箱中培養(yǎng)。每24～48 h換培養(yǎng)液1次，以保證細胞具有良好的生長狀態(tài)。DMEM培養(yǎng)基(高糖)，胰蛋白酶，胎牛血清，D-葡萄糖，碘化丙啶(PI)，細胞衰老β-半乳糖苷酶(SA β-gal)染色試劑盒，ROS檢測試劑盒，總一氧化氮(NO)檢測試劑盒。CO2培養(yǎng)箱，倒置相差熒光顯微鏡，酶聯(lián)免疫檢測儀，全自動流式細胞儀，低溫離心機。

1.2 細胞分組及給藥方法 用0.25%胰蛋白酶消化HUVEC，待細胞生長至對數(shù)生長期(即80%融合時)進行傳代。將HUVEC分為6個組。正常組給予5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖組給予25 mmol/L D-葡萄糖；五味子乙素1組給予25 mmol/L D-葡萄糖和5 μmol/L五味子乙素；五味子乙素2組給予25 mmol/L D-葡萄糖和10 μmol/L五味子乙素；五味子乙素3組給予25 mmol/L D-葡萄糖和15 μmol/L五味子乙素；五味子乙素4組給予25 mmol/L D-葡萄糖和20 μmol/L五味子乙素。各組細胞傳代20代后進行后續(xù)檢測。

1.3 細胞衰老評估 采用衰老相關的SA β-gal染色法評估細胞衰老情況，按試劑盒說明書操作，以SA β-gal染色陽性細胞(即衰老細胞)數(shù)占細胞總數(shù)的百分比表示細胞衰老情況。

1.4 細胞周期檢測 取各組細胞，采用PI法流式細胞儀分析各組細胞周期。

1.5 細胞內(nèi)ROS檢測 取各組細胞，采用ROS檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)的ROS水平。

1.6 細胞內(nèi)總NO檢測 取各組細胞,采用Griess reagent法測算細胞內(nèi)NO水平。

2 結果

2.1 各組衰老細胞百分比比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組衰老細胞百分比分別為4.18%±0.27%、5.76%±0.31%、5.28%±0.39%、4.98%±0.20%、4.87%±0.37%、4.36%±0.34%。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組衰老細胞百分比高于正常組；五味子乙素各組衰老細胞百分比低于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

2.2 各組細胞周期比較 高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組G0/G1期細胞比例高于正常組，S期細胞比例低于正常組；五味子乙素各組G0/G1期細胞比例低于高糖組，S期細胞比例高于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組細胞周期分布比較

注：與正常組比較,﹡P<0.01；與高糖組比較，﹟P<0.01。

2.3 各組細胞中ROS水平比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組細胞中ROS水平分別為251.63±15.04、495.82±10.39、421.71±9.09、363.06±17.88、292.67±12.27、264.74±14.38。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組ROS水平高于正常組；五味子乙素各組ROS水平低于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

2.4 各組細胞中NO水平比較 正常組、高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組、五味子乙素4組細胞中NO水平分別為(24.05±1.61)、(5.90±0.89)、(8.13±0.82)、(13.15±1.46)、(14.7±1.35)、(17.83±1.14)μmol/L。高糖組、五味子乙素1組、五味子乙素2組、五味子乙素3組NO水平低于正常組；五味子乙素各組NO水平高于高糖組；五味子乙素不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

3 討論

糖尿病大血管病變是2型糖尿病致殘、致死的主要原因。關于糖尿病大血管病變的防治目前仍處于控制相關危險因素的階段，缺乏特異性的藥物延緩其發(fā)生發(fā)展。近年來研究顯示，內(nèi)皮細胞功能障礙是糖尿病患者發(fā)生大血管病變的始動環(huán)節(jié)，而內(nèi)皮細胞衰老是內(nèi)皮完整性缺失進而發(fā)生血管并發(fā)癥的關鍵因素，因此，延緩內(nèi)皮細胞衰老將成為防治糖尿病大血管病變的新靶點。

關于細胞衰老的機制至今尚未完全明確，但目前公認的是端粒-端粒酶學說及氧化應激學說。細胞衰老是指年齡相關的細胞固有功能喪失，分為復制性衰老及非復制性衰老。目前復制性衰老研究較多，主要由于細胞有絲分裂中復制或增殖壓力導致的DNA損傷反應等復制障礙，引起細胞周期阻滯，其特殊形式是應激引起的早衰老。糖尿病大血管病變即屬于高糖致氧化應激損傷導致的血管內(nèi)皮細胞的早衰老。許多證據(jù)表明，細胞核內(nèi)端粒結構和功能與衰老密切相關，隨著細胞分裂周期性、漸進性損耗，最終引起細胞復制性衰老，而不單純依賴于端粒的長度[2～4]。端粒酶是在細胞中負責延長端粒的一種酶，是一種核糖核蛋白，以自身RNA模板合成端粒DNA，為細胞持續(xù)分裂提供遺傳基礎。一些研究表明，端粒酶可通過維持端粒長度、結構及功能來延緩細胞衰老[5,6]。高糖致氧化應激損傷促進內(nèi)皮細胞功能障礙是細胞衰老的主要原因之一[7]。Unterluggauer等[8]及本課題組前期研究[9]均報道,HUVEC衰老后，細胞周期分布特點是隨著葡萄糖濃度增加，G0/G1期的HUVEC比例逐漸增加，而S期HUVEC比例逐漸減少，糖濃度對細胞周期的影響具有時間依賴性，這表明細胞增殖能力隨著葡萄糖濃度的升高而下降，進一步證實高糖加速了HUVEC衰老的進程。

氧化應激損傷增強與NO生物利用度下降在內(nèi)皮細胞衰老中起著至關重要的作用[10，11]。NO與過量ROS反應而減輕細胞氧化應激損傷的程度。NO具有抗凋亡、抑制平滑肌細胞增殖、抗血小板聚集、抗白細胞黏附及調(diào)節(jié)血管管腔大小等多種作用，在抗動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮十分重要的作用[12～14]。本研究結果顯示，HUVEC傳代20代后正常組細胞仍維持較好的細胞增殖狀態(tài)，SA β-gal染色陽性細胞比例<5%;而高糖組細胞周期阻滯在G0/G1期，SA β-gal染色陽性細胞比例增多，ROS水平升高，NO水平明顯下降。這說明長期慢性高糖刺激后細胞氧化應激損傷加重，不僅使NO功能下降，同時可能使端粒酶活性下降、無法修復因應激損傷，導致端?？s短，進而發(fā)生內(nèi)皮細胞過早衰老。

五味子乙素為北五味子的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，其中抗氧化應激損傷是其非常重要的藥理作用。生物體中的自由基主要是氧自由基(如超氧陰離子自由基、羥自由基)。過多的氧自由基在體內(nèi)大量堆積可引起細胞毒性作用，造成蛋白、脂質(zhì)、DNA等生物大分子損傷，從而引起多種疾病[15]，如心臟病、阿爾茨海默病、帕金森病和腫瘤。研究顯示，五味子乙素可通過直接清除氧自由基[16]、提高抗氧化酶活性[17]、提高體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)的含量[18]、降低MDA和LDH水平[19]、減少ROS的產(chǎn)生[20]而發(fā)揮抗氧化作用。本研究采用四種不同濃度的五味子乙素作用于高糖誘導的HUVEC，結果顯示5～20 μmol/L的五味子乙素呈劑量依賴性延緩HUVEC衰老，表現(xiàn)為SA β-gal染色陽性細胞比例降低，G0/G1期細胞比例減少，細胞內(nèi)ROS水平降低，NO水平增高，尤其是20 μmol/L的五味子乙素抗衰老作用最為明顯。在后續(xù)實驗中我們將進一步增加五味子乙素的劑量，以篩選抗衰老作用最佳的藥物濃度，篩選適合長期補充、發(fā)揮抗內(nèi)皮細胞衰老作用的有效劑量，以延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，五味子乙素可延緩高糖誘導的HUVEC衰老進程，作用呈劑量依賴性。這種抗衰老作用可能與減輕氧化應激損傷、增加NO生物利用度、增強端粒酶活性進而修復端粒的作用有關。我們推測五味子乙素通過調(diào)節(jié)NO的合成，減少ROS的產(chǎn)生，減輕氧化應激損傷，延緩因氧化應激而加速的細胞復制性衰老進程；而氧化應激損傷減輕則可增強端粒酶的活性，發(fā)揮其延長端粒長度及修復端粒功能的作用，進而延長細胞的壽命，保持細胞增殖潛能，延緩細胞衰老進程。我們將在后續(xù)研究中進一步探討五味子乙素是否可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路、調(diào)節(jié)端粒酶活性及減輕氧化應激損傷而達到抗HUVEC衰老的作用。