高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定配制酒中5種紫杉烷

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(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院,湖北武漢 430075;2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430075)

紫杉烷是以紫杉醇為首的一類具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物的總稱,包括紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡?、?10-DAB)等[1-2]。紫杉烷主要存在于紅豆杉屬植物中,是紅豆杉屬植物的一個顯著特性。紫杉烷為新一代抗腫瘤藥物,臨床上用于治療乳腺癌等多種癌癥[3-5],然而會產(chǎn)生抑制骨髓造血功能、神經(jīng)毒性等副作用[6-9]。鑒于紅豆杉中紫杉烷的毒副作用,我國將紅豆杉列入“保健食品禁用物品名單”,禁止其作為保健食品和食品原料使用。但在利益驅(qū)使下,不法商家為了宣傳配制酒的保健功效,非法將紅豆杉添加到配制酒中的案例仍有發(fā)生。目前,我國尚未有專門識別與確證配制酒中是否添加紅豆杉的方法,因此,建立一種通過測定配制酒中紫杉烷含量來鑒別配制酒中是否非法添加紅豆杉的方法,具有重要現(xiàn)實意義。

目前,有關(guān)紫杉烷的檢測研究已有很多,檢測對象多為紅豆杉[10]、動物血液[11]和藥品[12]等,有關(guān)測定配制酒中紫杉烷從而鑒別配制酒中非法添加紅豆杉的研究未見報道。紫杉烷的檢測方法主要有紫外分光光度計法、液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[13-16],其中以HPLC-MS/MS檢測方法靈敏度最高,特異性好,耗時較短,且能應(yīng)用于多種紫杉烷的同時測定。為了準(zhǔn)確測定配制酒中紫杉烷含量,從而鑒別配制酒中非法添加紅豆杉的行為。本文選用HPLC-MS/MS技術(shù),選取5種紅豆杉中標(biāo)志性紫杉烷(紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇和10-脫乙?；涂ǘ、?作為研究對象,通過液-液萃取除雜,氮吹濃縮富集目標(biāo)物,甲醇復(fù)溶后過膜上機(jī)測定。該方法操作簡單,靈敏度高,具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足配制酒中5種紫杉烷的量檢測和非法添加的識別需求,為配制酒的科學(xué)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

網(wǎng)購紅豆杉酒(1種) 酒精度38% vol,配料為白酒、紅豆杉和松茸,產(chǎn)地江西省余江縣,購自淘寶網(wǎng);自制紅豆杉酒(3種) 酒精度50% vol,實驗室自制;添健酒(陰性空白基質(zhì)) 酒精度35% vol,湖北天健酒業(yè)有限公司;紅豆杉干果 產(chǎn)地云南省昭通市;紫杉醇、三尖杉寧堿 純度≥99.9%,中國食品藥品檢定研究院;巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;10-DAB 純度≥95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈、甲醇 色譜級,默克公司;甲酸 色譜級,賽默飛世爾公司;二氯甲烷,高錳酸鉀 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;95%食用酒精 食品級,鄭州市萬久化工產(chǎn)品有限公司;超純水 美國密理博公司純水機(jī)制備。

Triple Quad 4500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB Sciex公司;XS204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Allegra X-15R離心機(jī) 貝克曼庫爾特有限公司;DC-24氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;Elmasonic S180H超聲儀 德國艾爾瑪公司;Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇、10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,以甲醇溶解配制成1.0 mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃避光儲存。分別移取各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇配制為300 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-20 ℃避光儲存。

1.2.2 自制紅豆杉酒 食用酒精稀釋至50% vol,采用0.09 g/L高錳酸鉀氧化處理8 h,再用0.02%活性炭吸附處理24 h,達(dá)到脫臭要求[17]。參照李萬祥[18]的方法并做適當(dāng)改動,將紅豆杉干果粉碎(過40目篩),加入適量50% vol食用酒精,使紅豆杉干果含量分別為0.2%、1.0%和2.0%,浸提溫度20 ℃,浸提24 h,前12 h每1 h攪拌5 min,過濾得自制紅豆杉酒,實驗室編碼依次為S1～S3。

1.2.3 樣品前處理 精確稱取5 g(精確到0.01 g)配制酒樣品(網(wǎng)購紅豆杉酒、自制紅豆杉酒和添健酒)于50 mL離心管中,40 ℃氮吹濃縮至近干,采用6 mL二氯甲烷與3 mL超純水萃取,振蕩渦旋3 min,4000 r/min離心3 min,去除水相,將萃取液二氯甲烷于35 ℃氮吹至干,2 mL甲醇復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾后供HPLC-MS/MS檢測分析分析樣本中5種紫杉烷的含量。

1.2.4 實驗條件

1.2.4.1 液相條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18(100×2.1 mm,3 μm);流動相:0. 1%甲酸水(A)和100%乙腈(B);梯度洗脫程序:見表1,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積3 μL,柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution schedule

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);噴霧電壓(IS):5500 V;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子化溫度(TEM):450 ℃;氣簾氣(CUR):35 psi;霧化氣(GS1):40 psi;輔助加熱氣(GS2):40 psi;碰撞氣(CAD):Medium;所有氣體由氮氣提供(純度,99.999%),各化合物組分的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters for 5 taxanes

注:*為定量離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Analyst和MultiQuantTM軟件(美國AB Sciex公司)采集數(shù)據(jù)并積分,使用Microsoft Excel 2010(美國微軟公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 濃縮溫度的選擇 紫杉烷為熱敏性物質(zhì),在提取過程中易降解成小分子物質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化[19]。配制酒含有較高比例的水,常溫濃縮耗時過長,本課題選取水浴溫度為40、50、60 ℃進(jìn)行濃縮試驗。結(jié)果表明(圖1),5種紫杉烷回收率在溫度為40 ℃時最高,50 ℃次之,60 ℃最低,這可能是由于高溫環(huán)境下紫杉烷發(fā)生了降解或轉(zhuǎn)化。因此,本實驗最終選擇40 ℃進(jìn)行濃縮。

圖1 不同水浴溫度對5種紫杉烷回收率的影響Fig.1 Effect of different temperatureon the recovery of 5 taxanes

2.1.2 凈化條件的選擇 市售配制酒通常原料多樣化,往往呈黃褐色,基質(zhì)較為復(fù)雜,因此需凈化除雜,消除基質(zhì)干擾,提高靈敏度。大量研究表明[10,19-20],二氯甲烷與水萃取能較好分離紫杉烷與水溶性雜質(zhì),因此,本實驗采用二氯甲烷與水萃取去除配制酒中水溶性雜質(zhì),如糖、水溶性色素等,并優(yōu)化了萃取溶劑配比。分別選取二氯甲烷與水配比為6∶1、6∶3、6∶6和6∶9 (v∶v)進(jìn)行試驗,結(jié)果顯示,二氯甲烷與水配比為6∶6和6∶9時,紫杉醇和10-DAB的回收效果有所降低(圖2)。綜合考慮除雜效果和5種紫杉烷的回收率,最終選擇二氯甲烷與水6∶3 (v∶v)進(jìn)行液-液萃取。

圖2 不同萃取溶劑配比對5種紫杉烷回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solventratios on the recovery of 5 taxanes

2.2 色譜條件的選擇

考察了不同流動相對5種紫杉烷色譜峰的影響。分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水(含0.1%甲酸)作為流動相對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明,各流動相體系下5種紫杉烷均能呈現(xiàn)良好的峰型,但乙腈-水流動相體系信號響應(yīng)略低,其余兩體系信號相應(yīng)差異不大。考慮乙酸銨溶液長期作為流動相可能會堵塞管路以及操作的簡便性,最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。對梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明采用0.1%甲酸水-乙腈為流動相梯度洗脫能夠?qū)崿F(xiàn)5種紫杉烷化合物目標(biāo)峰的有效分離(圖3),5種紫杉烷化合物在11 min內(nèi)出峰完畢。

圖3 5種紫杉烷總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatogram of 5 taxanes注:1:10-DAB;2:巴卡亭Ⅲ;3:三尖杉寧堿;4:紫杉醇;5:7-表-紫杉醇。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

研究發(fā)現(xiàn),紫杉烷化合物呈現(xiàn)[M+Na]+和[M+H]+兩種電離模式[12,21-22],且結(jié)構(gòu)中富含氧原子的結(jié)構(gòu)容易形成[M+Na]+離子[23-24]。200 ng/mL的紫杉烷單標(biāo)溶液分別注入離子源(ESI源)中,正離子模式下,5種紫杉烷一級質(zhì)譜圖中[M+Na]+為主要基峰,[M+H]+響應(yīng)較弱,這可能與紫杉烷含有多個含氧基團(tuán)有關(guān)。但對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS/MS測定時,4種紫杉烷以[M+H]+模式下產(chǎn)生的定量和定性離子對的響應(yīng)明顯高于[M+Na]+所產(chǎn)生的,約為10～30倍,僅巴卡亭Ⅲ差異不大,其原因可能是流動相乙腈-0.1%甲酸水更有利于紫杉烷[M+H]+離子的形成。依據(jù)碎片離子響應(yīng),最終選取[M+H]+電離模式下產(chǎn)生的母離子和子離子作為定性、定量離子對,并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),具體見表2,碎片離子與文獻(xiàn)報道大致吻合[12]。

表3 5種紫杉烷的線性關(guān)系與檢出限Table 3 Linear relationship and detection limit for 5 taxanes

表5 紅豆杉酒中5種紫杉烷含量測定結(jié)果(μg/kg)Table 5 Determination results of 5 taxanes in Chinese yew wine(μg/kg)

2.4 線性范圍及檢出限

分別按0、6、15、30、45、60、90、120 ng/mL的水平配制5種紫杉烷化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以5種紫杉烷的色譜峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)做線性回歸,結(jié)果顯示,5種紫杉烷在0～120 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好(r≥0.9982),具體見表3。以S/N=3確定方法檢出限,紫杉醇、7-表-紫杉醇、巴卡亭Ⅲ檢出限為4 μg/kg,三尖杉寧堿、10-DAB檢出限為2 μg/kg。

2.5 方法回收率及精密度實驗

準(zhǔn)確稱取一定量的添健酒(陰性空白基質(zhì))樣品,分別按低、中、高3種不同濃度水平添加含5種紫杉烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品按1.2.2處理后進(jìn)行測定,分別計算5種紫杉烷的平均回收率。結(jié)果見表4,5種紫杉烷的回收率為71.84%～87.68%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%～8.82%,與文獻(xiàn)[25]中采用二氯甲烷與水萃取凈化的方法測定毛榛中紫杉醇含量,當(dāng)紫杉醇添加量為520 μg/kg時平均回收率為83.3%的結(jié)果接近。該方法具有較好的準(zhǔn)確度及精密度,可對配制酒中5種紫杉烷進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測。

表4 5種紫杉烷加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 4 Sampling recovery and relativestandard deviation of 5 taxanes(n=6)

2.6 樣品測定

將紅豆杉酒按照1.2.2進(jìn)行預(yù)處理,測定樣品中5種紫杉烷含量,重復(fù)測定兩次。結(jié)果見表5,在紅豆杉干果添加量為0.2%、1%、2%的自制紅豆杉酒和網(wǎng)購紅豆杉酒中,均能檢出5種紫杉烷化合物,并且各樣本中5種紫杉烷含量均以紫杉醇為最高,這可能是紅豆杉果實中紫杉醇含量高于其它4種紫杉烷所致[2]。在紅豆杉干果添加量為0.2%的配制酒中,紫杉醇含量為(157.80±8.77) μg/kg,約為檢出限的40倍;其余四種紫杉烷含量較低,其中三尖杉寧堿和10-DAB的含量僅與檢出限接近。因此,當(dāng)配制酒中紅豆杉添加量較低(干果添加量<0.2%)時,可以僅以紫杉醇作為指標(biāo)來輔助鑒別配制酒中是否加入紅豆杉。由此說明,通過本方法對配制酒中5種紅豆杉標(biāo)志性紫杉烷的定性定量檢測,能夠有效識別配制酒中非法添加紅豆杉的行為。

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了配制酒中5種紅豆杉標(biāo)志性紫杉烷(紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇、10-DAB)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品采用液-液萃取凈化,操作簡便,可在12 min內(nèi)實現(xiàn)5種紫杉烷的檢測分析。5種紫杉烷在0～120 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9982);紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇檢出限為4 μg/kg,三尖杉寧堿、10-DAB檢出限為2 μg/kg;回收率為71.84%～87.68%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%～8.82%。該方法操作簡單,靈敏度高,能對配制酒中5種紫杉烷進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測,解決了配制酒中非法添加紅豆杉難以識別和確證的難題,為配制酒的科學(xué)監(jiān)管提供有效技術(shù)有段。