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(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;)

中國有著千百年的酒文化歷史,適度飲酒有益于身心健康,但是長期飲酒具有潛在的不良影響。而近年來,由于人類飲酒頻率普遍增加以及膳食結(jié)構(gòu)的不平衡變化,酒精性肝的發(fā)病率日益增高[1],成為了肝臟疾病中第二大死亡原因[1-2]。而從天然產(chǎn)品和傳統(tǒng)藥用植物開發(fā)出來的藥物在酒精性肝病的預(yù)防和治療中越來越受到人們的重視[3-5]。因此,為預(yù)防和治療酒精相關(guān)性肝病,尋找有效和安全的天然產(chǎn)物是十分迫切的。

肝臟是人體重要的代謝器官,在各種內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)的代謝和解毒中起著至關(guān)重要的作用[6]。酒精性肝損傷主要是由于肝臟中氧化應(yīng)激引起的,由于酒精代謝主要在肝臟中進(jìn)行,代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基,而大量研究表明自由基通過參與脂質(zhì)過氧化代謝,引起細(xì)胞損傷[7]。當(dāng)肝臟中自由基過量,抗氧化系統(tǒng)便會(huì)失衡,炎癥因子大量積累,最終造成肝臟損傷[8]。

表1 小鼠分組及給藥方法Table 1 The groups of mice and methods of drug feeding

注:a:150 mg/kg·bw;A:300 mg/kg·bw;b:300 mg/kg·bw;B:600 mg/kg·bw。

蘆薈富含多種活性成分,一直作為一種傳統(tǒng)食品和藥物在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用[9-10],研究表明蘆薈提取物可以提高免疫力、治愈炎癥、緩解糖尿病并發(fā)癥、抑菌[11]。更有研究表明,蘆薈提取物在化學(xué)性[12]、藥物性[13]和酒精性肝損傷[14]中具有保護(hù)作用。蘆薈多糖是蘆薈葉肉中天然高分子化合物,是蘆薈主要功效性成分,主要由乙酰化的甘露糖、葡萄糖、乳糖等構(gòu)成,具有顯著的抗炎作用[15],并且蘆薈多糖可以有效改善酒精對(duì)小鼠造成的炎癥反應(yīng)[16],而茶多酚是多種多酚類化合物組合而成,被公認(rèn)為是天然的抗氧化劑[17],茶多酚可以清除自由基,緩解氧化應(yīng)激[18],從而具有抗病毒、抗炎、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)肝臟的作用[19-20]。因此,天然茶多酚是治療氧化應(yīng)激性肝損傷的優(yōu)良資源。

本研究采用長期42% vol低劑量酒精灌胃及1次50% vol酒精灌胃,造成小鼠酒精性肝損傷。并且,通過灌胃單一的蘆薈多糖或茶多酚,與灌胃蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚相比較,分析肝臟指數(shù)、病理學(xué)指標(biāo)、血清和肝臟生化指標(biāo),探討蘆薈多糖的抗炎與茶多酚的抗氧化協(xié)同作用對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。因此,本研究為蘆薈多糖和茶多酚的復(fù)合產(chǎn)品提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆薈凝膠凍干粉(庫拉索品種,從200 g新鮮蘆薈中制備1 g凍干粉) 云南萬綠生物股份有限公司;綠茶多酚(>98%) 陜西嘉禾生物科技有限公司;總蛋白、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及白介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;其余試劑均為分析純;C57BL/6小鼠(雄性,SPF級(jí),8周齡20±2 g) 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司,江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)審核編號(hào)JN.No20180330c2400510[48]。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司;101C-3B電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠;M5全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司;組織勻漿機(jī) 德國IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆薈多糖的制備 采用本實(shí)驗(yàn)室前期提取方法[16],取蘆薈凝膠凍干粉用適量蒸餾水溶解至澄清,再加入4倍體積的的無水乙醇充分?jǐn)嚢?、混合?；旌弦? ℃靜置過夜,待蘆薈多糖完全沉淀,混合液于4 ℃,5000 r/min,離心15 min,過濾沉淀物。并且用75%乙醇、無水乙醇、丙酮和無水乙醚連續(xù)洗滌沉淀物,采用Sevage法除蛋白(正丁醇∶氯仿=1∶4),蒸餾水透析(透析袋截留量分子量3500 Da)4次,每次2 h,最后進(jìn)行真空減壓濃縮并冷凍干燥即得蘆薈多糖。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 64只C57小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,小鼠被飼養(yǎng)在12 h光照和黑暗交替的環(huán)境下(溫度23±1 ℃,濕度60%),正常飲食和飲水,隨機(jī)分為8組,每組8只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,第二周開始灌胃,建模方法:第1～28 d胃42% vol酒精,第29 d 50% vol酒精[21],灌胃量均為0.10 mL/10 g,分組情況如表1。

表2 小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 2 Body weights and liver indexes of

注:與空白組相比,#表示差異顯著(P<0.05);##表示與空白組相比,差異極顯著(P<0.01);與模型組相比,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

1.2.3 樣品的采集與處理 小鼠末次灌胃后,各組小鼠空腹(禁食不禁水)9 h后,稱小鼠質(zhì)量,摘眼球取血,收集血液,并取出肝臟,稱量,-80 ℃保存。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 小鼠肝臟指數(shù)的測(cè)定 小鼠頸椎脫臼處死后解剖取肝臟,用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖凈表面浮血,濾紙拭干,稱質(zhì)量。計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)

1.2.4.2 肝臟病理學(xué)檢查 剪取肝左葉組織浸入4%多聚甲醛中固定,制作石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,并于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的形態(tài)變化、炎癥反應(yīng)、纖維化、脂肪空泡等病理改變。

1.2.4.3 血清生化指標(biāo) 摘眼球取血,放置30 min,4000 r/min離心15 min,分離血清于1.5 mL離心管中,4 ℃保存。按照試劑盒說明書方法檢測(cè)TC、TG、AST、ALT活力。

1.2.4.4 肝臟生化指標(biāo)的檢測(cè) 剪取剩余部分肝組織,用預(yù)冷生理鹽水沖洗并制備10%肝臟組織勻漿,4 ℃、5000 r/min離心15 min,分離上清液,按照試劑盒說明書方法檢測(cè)蛋白、GSH-Px、SOD活力以及MDA、GSH、TNF-α、IL-6含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)

如表2所示,各組小鼠體重和肝臟質(zhì)量差異不明顯。但是,比較各組小鼠肝臟指數(shù),相比于空白組,模型組的肝臟指數(shù)極顯著增加(P<0.01),并且相比于模型組,蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚低、高劑量組可以顯著(P<0.05)降低酒精導(dǎo)致的肝臟指數(shù)上升。相比于模型組,單獨(dú)蘆薈多糖與單獨(dú)的茶多酚組肝臟指數(shù)沒有顯著性差異。

因此,酒精代謝會(huì)造成小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)上升,但是在蘆薈多糖和茶多酚的干預(yù)下,這兩項(xiàng)指標(biāo)可以得到有效的改善,說明蘆薈多糖與茶多酚可有效地降低酒精性肝損傷小鼠的體重與肝臟指數(shù)。

2.2 小鼠肝組織病理形態(tài)

如圖1所示,空白組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝索有中央靜脈,肝細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞核正常,無水腫、脂肪變性或可見病變。而模型組中肝組織切片是典型的病理特征,包括肝細(xì)胞明顯腫脹、組織壞死、炎性浸潤和廣泛的空泡變性。相比于模型組,茶多酚低、高劑量組的小鼠肝細(xì)胞水腫情況有所改善,但肝小葉結(jié)構(gòu)仍然混亂。蘆薈多糖低、高劑量組炎性浸潤和空泡變性情況明顯改善。蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚低劑量組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂情況明顯減輕。

圖1 小鼠肝組織H&E染色(×200)Fig.1 H&E staining of liver tissuesin mice(×200)

圖2 小鼠血清生化指標(biāo)水平Fig.2 Levels of biochemical indicatorson serum in mice注:a:中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT;b:谷草轉(zhuǎn)氨酶AST;c:總膽固醇TC;d:甘油三酯TG。與空白組相比,#表示差異顯著(P<0.05);##表示與空白組相比,差異極顯著(P<0.01);與模型組相比,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);***表示差異高度顯著(P<0.001);圖3圖4同。

酒精代謝在酒精性肝病中起著至關(guān)重要的角色,酒精的代謝產(chǎn)物會(huì)損傷一系列器官和系統(tǒng)[22]。其中,肝臟作為機(jī)體主要的代謝器官,乙醇及其衍生物的代謝反應(yīng)導(dǎo)致肝臟毒性,引起炎癥反應(yīng),產(chǎn)生氧自由基,引起肝細(xì)胞損傷,甚至肝細(xì)胞壞死、肝纖維化[23-24]。因此,結(jié)合以上結(jié)果,蘆薈多糖和茶多酚可以有效地改善小鼠酒精性肝臟的組織病理學(xué)病變。

2.3 小鼠血清生化指標(biāo)水平

由圖2可知,與空白組相比,模型組小鼠血清AST、ALT、TG和TC水平極顯著增高(P<0.01),升高比例分別為48.9%、58.6%、56.7%、22.8%,說明酒精性肝損傷模型建立成功。29 d的干預(yù)實(shí)驗(yàn)下,除了茶多酚高劑量組不能抑制TC的增高,其余各劑量組均可抑制酒精導(dǎo)致的AST、ALT活力和TC、TG的增高。相比于模型組,茶多酚低劑量組在血清生化指標(biāo)上并沒有顯著性差異,而蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚低有普遍的顯著性差異,其中低劑量組的效果最為明顯。

臨床上,AST和ALT的活性被認(rèn)為是肝毒性的敏感指標(biāo)[25]。在本研究中,酒精可以極顯著引起AST和ALT的活性升高(P<0.01),說明成功建立了酒精性肝損傷模型。

在肝病的早期階段,TG在肝細(xì)胞中積累,導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生[26]。在AG-L組的治療中,可以降低TG在血清中的含量,并且AG&TP-H組的治療效果更好。但是,單獨(dú)的AG和TP治療組不能預(yù)防TC的升高。這些結(jié)果表明AG&TP組協(xié)同作用能預(yù)防急性酒精攝入引起的輕度脂肪肝。

2.4 小鼠肝臟生化指標(biāo)水平

生物機(jī)體具有一個(gè)有效的防御系統(tǒng)來保護(hù)和降低自由基引起的損傷,即通過內(nèi)源性抗氧化酶如GSH、SOD和GSH-Px來實(shí)現(xiàn)清除自由基和抗氧化功能[27],該抗氧化防御系統(tǒng)能及時(shí)且有效清除自由基,防止過氧化物介導(dǎo)的進(jìn)一步損傷[28]。然而,當(dāng)酒精攝入量造成的氧化應(yīng)激平衡被打破,超過人體清除能力時(shí),就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激,肝臟中的氧化應(yīng)激尤為明顯[6,29]。本研究通過檢測(cè)小鼠肝臟中的氧化應(yīng)激指標(biāo),如圖3中,經(jīng)過29 d的酒精刺激之后,與空白組相比,模型組的小鼠肝臟中GSH、GSH-Px和SOD均極顯著下降(P<0.01),分別下降了21.4%、20.2%、25.4%。其中,MDA是脂質(zhì)過氧化的第二產(chǎn)物,是反應(yīng)組織損傷的重要指標(biāo),被廣泛用作氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要指標(biāo)[30],但是模型組小鼠肝臟MDA的含量比空白組小鼠升高了26.2%(P<0.01)。通過單一的蘆薈多糖和茶多酚干預(yù),蘆薈多糖低劑量組的GSH含量與模型組相比沒有顯著差異(P>0.05),茶多酚高劑量也是如此。但是,蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚低劑量組卻可以顯著提高GSH(P<0.05)、GSH-Px(P<0.001)和SOD的活力(P<0.01),并且極顯著降低MDA的含量(P<0.01),結(jié)果表明蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚可以提高小鼠肝臟的抗氧化酶的活力,加速清除自由基。

圖3 小鼠肝臟生化水平Fig.3 Levels of biochemical indicators on Liver in mice 注:a:還原型谷胱甘肽GSH;b:谷胱甘肽過氧化氫酶GSH-Px;c:超氧化物歧化酶SOD;d:丙二醛MDA。

2.5 小鼠肝臟中炎癥因子IL-6和TNF-α的水平

圖4 肝臟中白介素-6IL-6(a)和腫瘤壞死因子-αTNF-α(b)的水平Fig.4 IL-6(a)and TNF-α(b)concentration in liver tissue

除了氧化應(yīng)激外,酒精性肝病的另一主要特征是炎癥細(xì)胞因子的代謝,TNF-α是肝損傷模型的關(guān)鍵介質(zhì),通過刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡[31],并且,IL-6能促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和分化[32]。如圖4所示,模型組的小鼠炎癥細(xì)胞因子水平IL-6和TNF-α極顯著高于空白組小鼠(P<0.01),分別升高了29.7%和42.3%,然而,相對(duì)于模型組,除了茶多酚高劑量組可以顯著降低IL-6的水平以外(P<0.05),其余單一組分的茶多酚或者蘆薈多糖均不能顯著降低炎癥細(xì)胞因子水平。只有蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚低劑量組可以同時(shí)顯著降低IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。因此,酒精可造成小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng),可使肝臟中炎癥因子TNF-α和IL-6的顯著增加,而蘆薈多糖和茶多酚可以有效地改善小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

綜上所述,本研究?jī)?yōu)選了蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚的復(fù)方,通過小鼠酒精性肝損傷模型,證明蘆薈多糖聯(lián)合茶多酚可以預(yù)防小鼠酒精性肝損傷,并且兩者聯(lián)合具有協(xié)同作用,效果比單一成分更顯著,其作用機(jī)制可能是抗自由基脂質(zhì)過氧化,以減輕慢性酒精攝入引起的氧化應(yīng)激和炎癥。本文為蘆薈多糖與茶多酚的產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。