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(1.漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,河南省腫瘤發(fā)生與防治創(chuàng)新型科技團(tuán)隊(duì),河南漯河 462002;2.河南省南街村(集團(tuán))有限公司,河南臨潁 462600)

力竭運(yùn)動(dòng)(Exhaustive exercise,EE)是指機(jī)體活動(dòng)超出機(jī)體承受能力直至無(wú)法再運(yùn)動(dòng),是一種超強(qiáng)度、超負(fù)荷運(yùn)動(dòng),因此機(jī)體對(duì)血、氧及能量的需求急劇增加,還會(huì)不斷生成自由基,勢(shì)必會(huì)對(duì)組織器官造成不同程度的損傷[1]。心臟是機(jī)體重要的供血循環(huán)動(dòng)力器官,對(duì)缺血缺氧十分敏感,極易誘發(fā)病變,這也是引發(fā)運(yùn)動(dòng)員心律失常、心功能衰竭甚至猝死的主要原因[2]。細(xì)胞自噬(Autophagy)是指真核細(xì)胞利用溶酶體將胞內(nèi)受損變性蛋白、有害因子或衰老細(xì)胞器進(jìn)行消化降解的程序化過(guò)程[3]。正常水平的自噬是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的正常生理過(guò)程,使機(jī)體免受損傷刺激的傷害,但若自噬過(guò)度亦可損傷正常細(xì)胞器或蛋白分子,誘發(fā)或加重器官組織損傷[4]。研究報(bào)道,力竭運(yùn)動(dòng)造成的心肌缺血缺氧損傷可誘導(dǎo)和提高心肌細(xì)胞自噬水平,導(dǎo)致心肌損傷或壞死等病理變化,出現(xiàn)心功能障礙[5-6]。

大豆肽(Soybean peptide,SP)是由大豆蛋白粉經(jīng)微生物發(fā)酵或酶解而得到一種短肽混合物,含有人體所需的8種必需氨基酸成分,易于消化和吸收。研究表明,大豆肽具有抗氧化、調(diào)血脂、抗疲勞、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激和抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[9]。本文將大豆肽灌胃給藥力竭運(yùn)動(dòng)大鼠,觀察其對(duì)大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)改變的影響,同時(shí)檢測(cè)大鼠心肌組織微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、Beclin-1及自噬相關(guān)因子7(Autophagy-related gene 7,Atg7)等自噬因子的表達(dá)變化,探討其抑制自噬相關(guān)作用機(jī)制,為提升其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康SD大鼠(動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(湘)2014-0006) SPF級(jí),雄性,8～10 w齡,體重180～220 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,將大鼠置于鼠籠中飼養(yǎng),每籠4～5只,飼養(yǎng)室溫度為22～25 ℃,濕度50%～60%,光照周期12 h:12 h,自由飲食水;大豆肽 分子量為500～3000 Da,臨用時(shí)用蒸餾水混懸,河南省南街村(集團(tuán))有限公司;戊巴比妥鈉 美國(guó)Sigma公司;肝素鈉注射液 江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司;LC3、Beclin-1、Atg7、β-actin抗體(兔抗鼠)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液(強(qiáng))、彩色預(yù)染蛋白分子量Marker(10～170 kDa)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、ECL顯色液、PVDF膜、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、總RNA提取Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒等 上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司;PCR引物設(shè)計(jì)與合成 上海捷瑞生物工程有限公司。

DW-86L578J超低溫冰箱 海爾生物醫(yī)療設(shè)備有限公司;FA1004電子分析天平 上海光學(xué)儀器廠;H1850高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Mini-PROTEAN? Tetra垂直電泳槽、T100TMPCR儀、Sub-Cell GT 水平電泳槽、ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)等 美國(guó)Bio-Rad公司;BL-420F生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng) 成都泰盟生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,置于盛有自來(lái)水的游泳訓(xùn)練水桶(高60 cm、直徑100 cm),水深50 cm,設(shè)置水溫為(33±2) ℃,將不會(huì)游泳或游泳能力較差(游泳時(shí)間<5 min)的大鼠去除。將篩選后的大鼠分為正常對(duì)照組(Control)、力竭運(yùn)動(dòng)模型組(Model)及大豆肽高、中、低劑量組,共5組,每組10只。正常對(duì)照組灌胃蒸餾水,不進(jìn)行強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng);力竭運(yùn)動(dòng)模型組灌胃蒸餾水,并強(qiáng)迫游泳至力竭;大豆肽高、中、低劑量組分別灌胃大豆肽500、250及125 mg/kg,并強(qiáng)迫游泳至力竭。給藥容量均為0.1 mL/100 g,每次于游泳前2 h灌服,連續(xù)4 周。

1.2.2 力竭運(yùn)動(dòng)大鼠動(dòng)物模型的制備 將大鼠尾部用鉛絲捆綁負(fù)重(鉛絲重量為體重5%)放入游泳訓(xùn)練水桶中,使其連續(xù)游泳直至力竭。大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn):大鼠在水中持續(xù)游動(dòng)直至不能再動(dòng),并沉入水中10 s以上不能上浮[9-10]。正常對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng),不進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng);力竭運(yùn)動(dòng)模型組及大豆肽組大鼠均進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動(dòng),隔2 d休息1次,持續(xù)4 w。末次力竭運(yùn)動(dòng)后,進(jìn)行大鼠血流動(dòng)力學(xué)、心肌組織病理學(xué)及相關(guān)因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平測(cè)定。

1.2.3 大鼠血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定 大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,于距離下頜2 cm至鎖骨上1 cm處切開(kāi)頸部皮膚約1 cm,逐層分離肌肉,游離右頸總動(dòng)脈約2～4 cm,結(jié)扎遠(yuǎn)心端,用動(dòng)脈夾夾閉近心端,將充滿(mǎn)肝素鈉注射液的心導(dǎo)管順著頸總動(dòng)脈向心臟方向緩慢推進(jìn)至預(yù)定部位,松開(kāi)動(dòng)脈夾,并及時(shí)打開(kāi)BL-420F生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)壓力傳感器上的三通管閥門(mén),在計(jì)算機(jī)上觀察到動(dòng)脈血壓曲線,此時(shí)繼續(xù)推進(jìn)心導(dǎo)管,直至在計(jì)算機(jī)屏幕上觀察到明顯的心室搏動(dòng)波形,表明心導(dǎo)管已插入左心室,固定心導(dǎo)管,30 min后待波形穩(wěn)定后記錄大鼠LVEDP、LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP、MABP及HR等參數(shù)[11]。

1.2.4 大鼠心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 取大鼠心尖組織約100 mg,生理鹽水沖洗干凈后,放入4%多聚甲醛溶液中固定,然后依次脫水、透明、浸蠟和包埋,切片(4 μm)后用HE染色,于顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平 取大鼠心肌組織約50 mg,用PBS沖洗干凈,用眼科剪快速充分剪碎,置于1.5 mL EP管中,加入1.0 mL Trizol并劇烈震蕩使其充分反應(yīng),4 ℃12000 r/min離心15 min,按照RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

表1 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響(n=10)Table 1 Effects of SP on left ventricular hemodynamic parameters in rats with exhaustive exercise(n=10)

注:與正常對(duì)照組比較:*表示P<0.05,差異顯著,**表示P<0.01,差異極顯著;與模型組比較:#表示P<0.05,差異顯著,##表示P<0.01,差異極顯著;表2～表3同。各基因引物序列為L(zhǎng)C3-F:5′-CTCTGTCATGGATGGAACCCAA-3′,LC3-R:5′-TACAGGTGTCACACAACGGAG-3′,產(chǎn)物255 bp;Beclin-1-F:5′-GAATGGAGGGGTCT AAGGCG-3′,Beclin-1-R:5′-CTTCCTCCTGGCTC TCTCCT-3′,產(chǎn)物180 bp;Atg7-F:5′-ACCCCAGG ACTGGTGATCTG-3′,Atg7-R:5′-GACACAGGAAA GGGTGCAACT-3′,產(chǎn)物107 bp;β-actin-F:5′-AACACCCCAGCCATGTACG-3′,β-actin-R:5′-ATGAGGGAGCGCGTAACC-3′,產(chǎn)物138 bp。

PCR反應(yīng)體系:cDNA 5 μL,上游引物5 μL,下游引物 2 μL,2×PCR MasterMix 1 μL,ddH2O 12 μL。

PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。于2.0%瓊脂糖凝膠上將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳,凝膠成像系統(tǒng)下拍照成像,讀取條帶光密度值并計(jì)算LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

表2 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平的影響(n=10)Table 2 Effects of SP on expression levels of mRNA of LC3,Beclin-1and Atg7 in myocardial tissue of rats with exhaustive exercise(n=10)

1.2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達(dá)水平 取大鼠心臟組織約100 mg,用眼科剪充分剪碎,置于2 mL離心管中,加入0.5 mL RIPA裂解液后用電動(dòng)勻漿器充分勻漿并反應(yīng)約15 min,移入1.5 mL EP管中,12000 r/min 4 ℃ 離心15 min,取上清即為蛋白提取物,然后進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整各樣本蛋白至10 μg/μL,按照Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗、顯影及拍照等操作,以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參,分析LC3、Beclin-1及Atg7 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響

如表1,與正常對(duì)照組比較,力竭運(yùn)動(dòng)模型組大鼠LVEDP極顯著升高(P<0.01),LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP及MABP極顯著降低(P<0.01)。與力竭運(yùn)動(dòng)模型組比較,大豆肽500 mg/kg組大鼠LVEDP極顯著降低(P<0.01),LV dp/dt max、LVSP及MABP極顯著升高(P<0.01),LV dp/dt min顯著升高(P<0.05);大豆肽250 mg/kg組大鼠LVEDP極顯著降低(P<0.01),LV dp/dt max、LVSP及MABP極顯著顯著升高(P<0.01);大豆肽125 mg/kg組大鼠LVEDP顯著降低(P<0.05)。

2.2 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌病理學(xué)變化的影響

心肌組織HE染色鏡下觀察顯示,正常對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)完整,橫紋清晰,未見(jiàn)明顯病變(圖1A);力竭運(yùn)動(dòng)模型組大鼠表現(xiàn)為廣泛的心肌肌束紊亂,細(xì)胞明顯腫脹,可見(jiàn)部分細(xì)胞變性、壞死,心肌間質(zhì)有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B);大豆肽500 mg/kg組大鼠心肌組織較模型組明顯改變,橫紋趨于清晰,可見(jiàn)散在、少量的白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。

圖1 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織病理學(xué)變化的影響(200×)Fig.1 Effects of SP on myocardial histopathologicalchanges in rats with exhaustive exercise注：A為正常對(duì)照組，B為力竭運(yùn)動(dòng)模型組，C為大豆肽500 mg/kg組。

2.3 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平的影響

如圖2,模型組中LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA條帶光密度增加;500 mg/kg大豆肽劑量組與模型組相比條帶光密度降低。如表2,與正常對(duì)照組比較,力竭運(yùn)動(dòng)模型組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,大豆肽500 mg組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.01)。

表3 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 蛋白表達(dá)水平的影響(n=10)Table 3 Effects of SP on expression levels of LC3,Beclin-1and Atg7 mRNA in myocardial tissue of rats with exhaustive exercise(n=10)

圖2 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of SP on expression levels of LC3,Beclin-1 and Atg7 mRNA in myocardialtissue of rats with exhaustive exercise注：1為正常對(duì)照組；2為力竭運(yùn)動(dòng)模型組；3為大豆肽 500 mg/kg組；圖3同。

2.4 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3,模型組中LC3、Beclin-1及Atg7蛋白條帶光密度增加;500 mg/kg大豆肽劑量組與模型組相比條帶光密度降低。如表3,與正常對(duì)照組比較,力竭運(yùn)動(dòng)模型組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,大豆肽500 mg組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖3 大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of SP on expression levels ofLC3,Beclin-1 and Atg7 mRNAin myocardial tissue of rats with exhaustive exercise

3 討論

心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)異常是力竭運(yùn)動(dòng)心臟病變的重要病理基礎(chǔ),主要是由于心肌缺血缺氧產(chǎn)生大量的自由基、炎癥因子等有害物質(zhì),從而抑制心臟功能直至衰竭[12]。本研究發(fā)現(xiàn)大豆肽500 mg/kg可顯著降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠LVEDP,升高LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP及MABP等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù);同時(shí)大豆肽500 mg/kg可明顯改善力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織的病理學(xué)變化,使心肌結(jié)構(gòu)損傷減少,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)降低。由此可知大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)有一定的改善作用,并能緩解心肌病理性損傷,提示其對(duì)心臟具有一定的保護(hù)作用,這與參考文獻(xiàn)[9]結(jié)果一致。

大豆肽500 mg/kg可極顯著降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA和蛋白表達(dá)水平,提示大豆肽改善力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心功能和血流動(dòng)力學(xué)的作用機(jī)制與其抑制細(xì)胞自噬相關(guān)。研究報(bào)道,力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌缺血缺氧損傷可過(guò)度激活心肌細(xì)胞自噬,而自噬水平升高可誘發(fā)或加重心肌細(xì)胞損傷,降低心臟的舒縮功能,引發(fā)心律失常、心肌壞死及心功能障礙等疾病[13]。自噬是機(jī)體細(xì)胞為清除胞內(nèi)衰老、損傷或壞死的蛋白質(zhì)、代謝物和細(xì)胞器等而自發(fā)的一種保護(hù)性生物學(xué)行為,以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需求和部分細(xì)胞器的更新[14]。但若細(xì)胞自噬行為過(guò)于激烈,使胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解過(guò)多或使正常細(xì)胞器損傷,可誘發(fā)細(xì)胞自噬性死亡、凋亡或壞死等,從而導(dǎo)致組織器官損傷、功能障礙或疾病的發(fā)生[15]。

細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí),LC3以Pro-LC3形式存在,其C末端被Atg4水解暴露甘氨酸形成LC3Ⅰ,主要存在于胞漿中,當(dāng)細(xì)胞被氧化應(yīng)激等損傷因素刺激時(shí)自噬行為被激活,LC3ⅠC末端甘氨酸殘基與Atg7、Atg3活性位點(diǎn)形成硫脂鍵,促進(jìn)LC3Ⅰ與磷脂結(jié)合即形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ穩(wěn)定結(jié)合在自噬體膜上并不斷聚集,促進(jìn)自噬體的形成,可見(jiàn)LC3Ⅱ的表達(dá)量與自噬程度或自噬體數(shù)量存在正比關(guān)系,所以可通過(guò)檢測(cè)LC3(LC3Ⅰ和LC3Ⅱ)的表達(dá)水平初步判斷細(xì)胞的自噬行為[16]。Beclin-1主要與PI3K形成復(fù)合體介導(dǎo)其他自噬蛋白(如Atg、LC3等)定位于自噬泡,從而啟動(dòng)自噬,并參與和調(diào)控自噬體的形成與轉(zhuǎn)歸[17]。由此可見(jiàn),在自噬發(fā)生的過(guò)程中,LC3、Beclin-1及Atg7等因子與之密切相關(guān),調(diào)控自噬的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,大豆肽對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟功能、血流動(dòng)力學(xué)及病理性損傷有一定的改善作用,其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞自噬相關(guān)。