吳翼 劉蕊 郭愛汕 李靜 楊耀東

摘要：應(yīng)用硅膠干燥法對棕櫚科3個不同屬作物椰子、油棕和檳榔的葉片經(jīng)干燥處理后置于不同溫度條件下保存3個月，以新鮮葉片為對照，采用簡易十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，分析硅膠干燥處理后對DNA提取效果的影響。研究結(jié)果表明，硅膠干燥法處理的葉片提取的基因組DNA質(zhì)量較好，與對照無明顯差異，完全可以應(yīng)用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。硅膠干燥法處理的葉片在常溫條件下保存即可達到后續(xù)試驗的要求，這為今后棕櫚科植物試驗材料的中短期保存提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞：棕櫚科植物;硅膠干燥;DNA提取;椰子;油棕;檳榔

中圖分類號： S590.1文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0083-03

收稿日期：2018-08-31

基金項目：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（編號：1630152017019、1630152017007）。

作者簡介：吳?翼（1980—），男，海南文昌人，碩士，助理研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：wuyi-scuta@163.com。

通信作者：楊耀東，博士，副研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：yyang8@qq.com。

棕櫚科植物是單子葉植物中一個非常有特色的植物類群，全世界共有200多屬3 000余種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。原產(chǎn)于美洲、澳洲的棕櫚科植物種類最多，約有100屬1 400種，少數(shù)原產(chǎn)于非洲和歐洲[1]，原產(chǎn)于我國的有18屬117種，主產(chǎn)地為云南、廣東、海南、廣西、臺灣、福建、四川、湖南、江西、貴州，西藏的一些溫暖地區(qū)也有分布[2]。

提取完整的基因組DNA是分子生物學(xué)研究的起點。野外采集葉片材料時往往很難及時帶回實驗室進行低溫保存而使材料發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響DNA的提取效果。硅膠脫水干燥法保存植物樣品操作方便，不受時間限制，已在多種作物中應(yīng)用[3-9]，均取得較好的效果，而在棕櫚科植物上的應(yīng)用未見報道。本研究對棕櫚科植物椰子、油棕和檳榔的葉片分別采用硅膠脫水干燥后置于25 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存3個月，以新鮮葉片為對照，采用簡易十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對3種不同處理的樣品進行基因組DNA提取效果的比較分析，探討硅膠干燥葉片對棕櫚科植物DNA提取的影響，以期為今后棕櫚科植物材料的長期保存提供新的方法。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

以椰子、油棕和檳榔3種棕櫚科植物為試驗材料，均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所種質(zhì)圃。取完全展開的新鮮葉片，用變色硅膠干燥后置于25 ℃（常溫）、-20 ℃和-80 ℃ 保存3個月后提取基因組DNA，同時以新鮮葉片為對照（CK）。

1.2?試驗方法

1.2.1?DNA的提取方法?采用CTAB法，參考吳翼等的方法[10]，具體步驟：（1）取約2 g幼葉新鮮材料或約1 g干燥材料在研缽中加液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加約5 mL提取液，搖勻，置于冰上，將所有材料研磨完后，進行下一步操作。（2）離心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），棄去上清（小心管內(nèi)粉末）。再次加入約5 mL提取緩沖液，搖勻，離心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），小心棄去上清。（3）在管中加入5 mL 65 ℃預(yù)熱的裂解液，搖勻。65 ℃水浴90～120 min，每30 min 搖1次。（4）裂解后冷卻2 min，加等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶1）抽提液，搖勻（搖50次左右，再渦旋約2 min）至乳濁液。15 min、8 000 r/min、25 ℃離心。（5）吸取上清，轉(zhuǎn)入新的15 mL離心管，加入0.6倍體積的冰凍異丙醇和0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH值5.2），緩慢搖勻至沉淀析出。（6）將離心管離心（3 min，8 000 r/min，25 ℃）。再將沉淀轉(zhuǎn)入2 mL離心管，用70%乙醇1 mL洗滌2次。加70%乙醇1 mL浸泡過液。（7）去鹽離子及可溶于乙醇的雜質(zhì)：次日，用70%乙醇1 mL洗1次，自然風(fēng)干或者離心干燥后加0.7 mL的滅菌水溶解。（8）加等體積酚+三氯甲烷+異戊醇（體積比25 ∶24 ∶1）抽提液，冷卻2 min，搖勻（約50次后再渦旋30 s），離心（15 min，8 000 r/min，25 ℃）。（9）取上清加等體積三氯甲烷+異戊醇（體積比24 ∶1）抽提液，冷卻后，搖勻（約50次后再渦旋30 s），離心15 min，8 000 r/min，25 ℃。（10）吸取上清，加入2倍體積的冰凍乙醇和0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH值5.2），緩慢搖勻至沉淀析出。-20 ℃下放置1 h以上。（11）離心（3 min，8 000 r/min，25 ℃），用0.1 mL槍頭吸干，再用70%乙醇洗2次（去鹽離子）。盡可能吸干凈乙醇，自然風(fēng)干或者離心干燥至DNA略有潮濕，用TE（根據(jù)DNA多少確定用量）溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?DNA檢測方法?（1）紫外分光光度計檢測。取2 μL DNA樣品加ddH2O稀釋50倍至100 μL，用紫外分光光度計測定D230 nm、D260 nm、D280 nm以及D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值，判斷DNA的純度;再根據(jù)公式計算DNA樣品濃度，具體公式：DNA樣品濃度=D260 nm×稀釋倍數(shù)×50/1 000。（2）2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取出一定量的DNA，稀釋成100 ng/μL，取8 μL在2%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照，根據(jù)λ-DNA判斷基因組DNA的分子質(zhì)量和大小。（3）簡單重復(fù)序列（SSR）-PCR擴增檢測。分別以所提取的DNA為模板進行SSR-PCR擴增。所用SSR引物Co107的序列分別為5′-CAGTAGTGCCCAAGAATAGA-3′和5′-TGCGTCACACACACACAG-3′，由Bioneer公司合成;25 mmol/L MgCl2、4×10 mmol/L dNTPs、5 U/μL Taq DNA 聚合酶、10×Taq Buffer均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR擴增在TaKaRa-TP 600擴增儀上進行，其擴增體系與擴增程序如下：總體積為20 μL，其中10×PCR Buffer 20 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）0.5 μL，SSR引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，模板DNA（20 ng/μL）2 μL。擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，25個循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2?結(jié)果與分析

2.1?紫外分光光度法檢測結(jié)果

CTAB法提取的DNA沉淀呈透明膠狀，沒有酚類氧化或其他色素造成的污染。由表1、表2、表3可見，DNA溶液的D260 nm/D280 nm值大部分為1.70～1.90，D260 nm/D230 nm值在2.0左右，進一步說明提取的DNA較純，RNA較少，多糖、蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)污染也較少。與對照組（CK）相比，硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA的D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值較接近，無明顯差異。

2.2?瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1、圖2、圖3）可以看出，3種棕櫚科植物材料提取的DNA條帶整齊、清晰、無明顯彌散現(xiàn)象，表明DNA完整性較好，降解較少。點樣孔亮度微弱，表明提取到的DNA純度高，蛋白質(zhì)、酚類及多糖類等雜質(zhì)去除得較徹底。由圖1和圖2可知，椰子、油棕各個處理所提取的DNA純度都較好，條帶整齊、清晰，與λDNA接近。硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA（泳道4～12）與對照組（泳道1～3）無明顯差異;圖3顯示，檳榔各個處理的DNA條帶均暗于λDNA，硅膠干燥處理的葉片所提取的DNA（泳道4～12）均略有降解現(xiàn)象，相比對照組（泳道1～3）DNA質(zhì)量差。

2.3?基因組DNA的PCR擴增結(jié)果

用SSR引物Co107對所提取的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。由圖4可知，3種棕櫚科植物的不同處理所提取的DNA均獲得了清晰的擴增條帶。從硅膠干燥處理樣品中提取的DNA與從鮮葉中提取的DNA采用同一引物擴增，所得譜帶基本無差異。

3?討論

CTAB是一種強去污劑，能溶解細(xì)胞膜，還能有效地去除糖類雜質(zhì)。目前此法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于植物基因組DNA的提取。本研究結(jié)果進一步表明，CTAB法不僅適合椰子、油棕和檳榔等棕櫚科植物新鮮葉片的DNA提取，同時也適合棕櫚科植物硅膠干燥葉片的DNA提取。

本研究在DNA提取的過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮葉片在研磨時較干燥葉片更容易些;新鮮葉片在研磨完成時須快速轉(zhuǎn)入離心管中，并添加含有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和β-巰基乙醇的提取液，否則容易引起褐化，而干燥葉片研磨后也不易褐化，這與何天明等的研究結(jié)果[6]相同;新鮮葉片置冰箱冷凍后取出，有凍傷現(xiàn)象，出現(xiàn)水漬狀，而干燥葉片無此現(xiàn)象。

紫外分光光度計檢測結(jié)果表明，從硅膠干燥處理的葉片樣品中提取的DNA，純度較高，其D260 nm/D280 nm值為1.70～190，D260 nm/D230 nm值約為2.0，與從新鮮葉片樣品中提取的DNA無明顯差異，這與李學(xué)營等的研究結(jié)果[4，7，11]相似，表明葉片干燥處理后置于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）短期保存（3個月），其DNA質(zhì)量也無明顯差異。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進一步表明，硅膠干燥處理的葉片仍能提取出高質(zhì)量的DNA，除檳榔的DNA略有降解外，椰子和油棕干燥處理的葉片提取的DNA與對照組無明顯差異，表明葉片干燥處理后短期保存（3個月）于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）條件下，其DNA質(zhì)量也無明顯差異。通過SSR-PCR擴增檢測，發(fā)現(xiàn)所有提取的DNA均能擴增出清晰一致的條帶，進一步表明從硅膠干燥處理葉片中提取的DNA質(zhì)量較好，能滿足分子生物學(xué)試驗的要求，這對遠距離取樣研究棕櫚科植物居群遺傳多樣性是很有用的。

4?結(jié)論

從硅膠干燥處理的棕櫚科植物葉片樣品中提取的DNA質(zhì)量較好，能滿足分子生物學(xué)試驗的要求;葉片干燥處理后短期保存（3個月）于不同溫度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）條件下，其DNA質(zhì)量無明顯差異;硅膠快速干燥葉片法能解決在棕櫚科植物種質(zhì)資源調(diào)查與收集時，不能及時將新鮮材料帶回實驗室而引起的褐化問題，同時干燥后的葉片長期保存不易變質(zhì)，在DNA提取過程中也不易產(chǎn)生褐化。因此，硅膠干燥法是一種簡便實用的理想方法。

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