液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定土壤中的獸藥殘含量的方法改進(jìn)

陳永銳，伍愛梅

液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定土壤中的獸藥殘含量的方法改進(jìn)

陳永銳，伍愛梅

（廣東中藍(lán)檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000）

土壤中的獸藥殘留含量是衡量土壤污染程度的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。目前測(cè)定土壤中獸藥殘留含量的常用方法是液質(zhì)聯(lián)用法，但傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用法存在操作困難、檢出量較大的缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過固相萃取和梯度洗脫的方法對(duì)傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后檢出范圍均為0.1～500 μg/L，同時(shí)還具備靈敏度高、操作簡(jiǎn)易、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可以滿足對(duì)土壤中獸藥殘留含量的檢測(cè)要求。

獸藥；四環(huán)素類抗生素；液質(zhì)聯(lián)用；固相萃取

獸藥殘留通常指給動(dòng)物使用藥物后蓄積和貯存在細(xì)胞、組織和器官內(nèi)的藥物原形、代謝產(chǎn)物和藥物雜質(zhì)。在現(xiàn)代社會(huì)，由于畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，現(xiàn)代化、集約化和規(guī)模化的生產(chǎn)方式已經(jīng)成為了當(dāng)今中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的主流。常見的獸藥殘留有抗微生物藥物（抗生素和化學(xué)合成抗菌素的統(tǒng)稱）、抗寄生蟲藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和殺蟲劑等?？刮⑸锼幬锸亲钪饕墨F藥，添加劑和獸藥殘留占藥物添加劑總量的60%左右，而這其中四環(huán)素類抗生素（土霉素、四環(huán)素和金霉素）由于價(jià)格低廉且具有較強(qiáng)的殺菌抗炎效果而被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。而未被吸收分解的四環(huán)素類抗生素會(huì)以糞便或尿液的形式排出體外，四環(huán)素類抗生素在自然環(huán)境中分解緩慢因而會(huì)導(dǎo)致土壤污染。為了檢測(cè)飼養(yǎng)場(chǎng)糞便處理廠附近的土壤中的情況，就需要對(duì)其土壤進(jìn)行檢測(cè)。四環(huán)素類抗生素等獸藥殘留屬于微量至超微量的分析范疇，這對(duì)于儀器及分析方法都有較高要求。目前，常用的測(cè)量土壤中四環(huán)素類抗生素的方法是液質(zhì)聯(lián)用法，本文對(duì)傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行了改進(jìn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器主要有：Agilent LC/MSD Trap XCT型電噴霧離子阱質(zhì)譜搭配Agilent1100超高效液相色譜儀、JIUPIN-COS-2403CL恒溫震動(dòng)搖床、JIDI-20R臺(tái)式多用途高速冷凍離心機(jī)、超聲波清洗機(jī)。

1.2 試劑與材料

本次實(shí)驗(yàn)試劑、材料規(guī)格及產(chǎn)地如表1所示。

1.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.3.1 EDTA緩沖溶液的配置

首先將1 L質(zhì)量濃度為0.1 mol/L檸檬酸溶液與0.625 L質(zhì)量濃度為0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液相混合，然后加入0.5 L質(zhì)量濃度為0.1 mol/L的EDTA溶液，調(diào)節(jié)pH至4.0左右。

表1 試劑與材料規(guī)格及產(chǎn)地表

名稱規(guī)格產(chǎn)地 乙腈色譜純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 甲酸色譜純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 乙二胺四乙酸二鈉優(yōu)級(jí)純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 三氯乙酸優(yōu)級(jí)純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 檸檬酸優(yōu)級(jí)純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 磷酸氫二鈉優(yōu)級(jí)純中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 土霉素純物質(zhì)安譜 四環(huán)素純物質(zhì)安譜 金霉素純物質(zhì)安譜

1.3.2 土壤的采集

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的土壤為浙江省湖州市安吉縣某年出欄量為500頭左右的小型養(yǎng)豬場(chǎng)的糞便處理池附近的種植耕地，這些種植耕地每年都會(huì)施加兩三次該廠區(qū)糞便（已連續(xù)5年以上）。本次在此種植地隨機(jī)取樣，取樣點(diǎn)分別采取地表層土壤（0～20 cm處）樣品和亞表層土壤樣品（20～40 cm處），同時(shí)采集該地區(qū)遠(yuǎn)離糞便處理區(qū)且從未施加過糞便的土壤作為空白樣。

1.3.3 土壤的處理

由于土霉素、四環(huán)素和金霉素均屬于高極性的弱酸弱堿化合物，易與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此本實(shí)驗(yàn)分別采用三氯乙酸和EDTA來提取土壤中的這些物質(zhì)。

分別稱取土壤樣品5 g置于錐形瓶中，加入20 mL的EDTA緩沖溶液，充分震蕩后取上層提取液，重復(fù)3次后，將3次提取的上層提取液加入體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸0.5 mL，混均靜置后，置于離心機(jī)，8 000 r/min的條件下離心5 min。取上清液利用固相萃取柱（HLB小柱）對(duì)其進(jìn)行富集，乙腈洗脫，氮吹至近干，用初始流動(dòng)相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）定容1 mL，過膜待測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

用初始流動(dòng)相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）配制四環(huán)素、土霉素和金霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，再稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的條件

使用 LC-MS/MS 法測(cè)定土壤中四環(huán)素類抗生素殘留量。超高效液相色譜的色譜柱為ACQUTTY HPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.2 mL/min，其流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫，程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序

時(shí)間/min流速/（mL/min）流動(dòng)相A/（%）流動(dòng)相B/（%） 00.21090 1.50.21090 30.25050 40.29010 5.50.29010 90.25050 120.21090

液相色譜所串聯(lián)質(zhì)譜儀使用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為120 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣為氮?dú)?，脫溶劑氣流速?00 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)，測(cè)定使用ESI正離子模式，進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與討論

在上述實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。本實(shí)驗(yàn)的土霉素、四環(huán)素和金霉素的檢出范圍均為0.1～500 μg/L，在該范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的線性相關(guān)，色譜的峰型較為尖銳，其線性相關(guān)系數(shù)的值均大于0.998 9，儀器重現(xiàn)性RSD均小于1%。以此為樣品對(duì)土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如表3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：糞便處理池附近的種植耕地的土壤樣品中的四環(huán)素類抗生素含量較高，土壤亞表層的四環(huán)素類抗生素為土壤表層1/3～1/2的水平。

遠(yuǎn)離糞便處理區(qū)且從未施加過糞便的土壤仍檢測(cè)出四環(huán)素類抗生素，這說明四環(huán)素類抗生素可能具有很強(qiáng)的環(huán)境遷移性，需要引起相關(guān)部門的注意。

表3 土壤樣品中的土霉素、四環(huán)素和金霉素含量情況

樣品名土霉素含量/（μg/kg）四環(huán)素含量/（μg/kg）金霉素含量/（μg/kg） 樣品A 表層342425167 樣品A亞表層15613299.9 樣品B表層43.611.215.4 樣品B亞表層15.98.453.56

注：糞便處理池附近的種植耕地的土壤樣品為樣品A，遠(yuǎn)離糞便處理區(qū)且從未施加過糞便的土壤為樣品B。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與展望

為了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)出土壤中的獸藥殘留含量，為土壤實(shí)時(shí)檢測(cè)提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)以土壤中獸藥殘留含量最高的四環(huán)素類抗生素為例，通過固相萃取、梯度洗脫的方法對(duì)液質(zhì)聯(lián)用測(cè)量土壤中四環(huán)素類抗生素含量的方法進(jìn)行了改進(jìn)。此改進(jìn)方法既可以提高對(duì)土壤中的獸藥殘留的提取效率，又可以準(zhǔn)確定性土壤中獸藥殘留物質(zhì)，檢出范圍均為0.1～500 μg/L，且具有較好的重現(xiàn)性，還具備靈敏度高、操作簡(jiǎn)易的特點(diǎn)，可以滿足土壤獸藥殘留含量檢測(cè)的要求。

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了一種通過液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定土壤中獸殘含量的方法，這將大大提高獸藥殘留物組分的測(cè)量精度和速度。但僅有測(cè)量方法還不夠，解決獸藥殘留的根本還在于制訂相應(yīng)的法律法規(guī)，嚴(yán)格規(guī)范獸藥的安全生產(chǎn)和使用，同時(shí)，還要加大宣傳，學(xué)習(xí)和借鑒國(guó)外先進(jìn)的飼養(yǎng)管理技術(shù)，合理使用獸藥。

［1］勾新磊，劉偉麗，高峽，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在食品藥品安全分析領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016（11）：4283-4288.

［2］張志強(qiáng)，李春花，黃紹文，等.土壤及畜禽糞肥中四環(huán)素類抗生素固相萃取——高效液相色譜法的優(yōu)化與初步應(yīng)用［J］.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2013，19（3）：713-726.

TS207.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.049

2095－6835（2019）15－0120－02

〔編輯：張思楠〕