翟明明，劉娟，羅二平，湯池

空軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安710032

前言

在適應(yīng)高海拔地區(qū)的低壓低氧、寒冷以及太陽輻射增加等極端環(huán)境過程中，來自低海拔的個體會在代償范圍內(nèi)發(fā)生多種代謝變化，但持續(xù)的缺氧會最終導(dǎo)致組織細胞缺氧損傷。越來越多的研究結(jié)果表明高海拔地區(qū)發(fā)生氧化應(yīng)激（Oxidative Stress,OS）損傷嚴重，血漿和尿液等過氧化反應(yīng)標志物活性升高明顯，例如硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)、羥基壬烯醛、8-羥化脫氧鳥苷等［1-3］。過量的活性氧自由基產(chǎn)生易導(dǎo)致癌癥、心肺疾病、肝臟疾病等［4-5］。高海拔地區(qū)因氧分壓低而造成的組織缺氧會誘發(fā)肝臟氧自由基代謝紊亂，抗氧化劑超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活性降低，丙二醛（Methane Dicarboxylic Aldehyde,MDA）含量顯著上升等，造成OS損傷［6］。目前文獻報道研究多集中在高原腦、心、肺損傷等方面，而針對高原氧分壓降低導(dǎo)致的肝臟損傷防治的研究相對匱乏。

脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Field,PEMF）作為一種安全非侵入式物理干預(yù)手段，已經(jīng)被用作藥物治療的替代方式，用于多種疾病的治療研究。PEMF可以顯著促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化［7］。PEMF可以降低活性氧自由基水平，增強成骨細胞的抗OS反應(yīng)［8］。此外，PEMF還可以提高db/db小鼠血清SOD活性，降低MDA含量，改善肝臟OS［9］。然而，在低壓低氧環(huán)境下誘發(fā)的肝臟OS反應(yīng)，是否可以使用PEMF進行有效干預(yù)改善，尚不得而知。

本研究基于低壓低氧艙模擬高原環(huán)境，建立缺氧性小鼠肝臟損傷動物模型，探究模擬高原低氧環(huán)境下PEMF對肝臟OS的影響，為將PEMF用于高原缺氧性肝臟損傷防治研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物實驗獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會批準。雄性SPF級小鼠15只，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。動物在標準環(huán)境下飼養(yǎng)：12 h/12 h明暗交替，溫度調(diào)節(jié)（22±1）℃，自由攝食、水。

1.2 主要儀器和試劑

二奎琳甲酸（Bicinchoninic Acid,BCA）蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司。抗體均購自Santa公司。ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。甘油三酯（Triglyceride,TG）、MDA、還原谷胱甘肽（Reduced Glutathione,GSH）/氧化型谷胱甘肽（Oxidized GSH,GSSG）定量試劑盒，以及肝臟過氧化氫酶（Catalase,CAT）、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-Px）活性檢測試劑盒等均購自南京建成生物工程有限公司。

1.3 PEMF發(fā)生裝置

如圖1所示，PEMF發(fā)生系統(tǒng)主要由兩部分構(gòu)成：一部分為脈沖電磁發(fā)生器，另一部分為赫姆霍茲線圈（線圈直徑20 cm，內(nèi)繞80匝直徑1 mm銅線，兩個線圈的中心距離為10 cm）。該低強度PEMF發(fā)生裝置通過電源電路供給強度調(diào)節(jié)電路和脈沖發(fā)生器，為整機提供電源，產(chǎn)生的脈沖信號經(jīng)過開關(guān)功放電路至輸出電路，另配有顯示電路、保護電路和報警電路。該PEMF可以產(chǎn)生頻率一定、強度可調(diào)的開放環(huán)路輸出波形，通過赫姆霍茲線圈后，在線圈的中心部分形成場強相對均勻的PEMF，使用高斯計對線圈內(nèi)部的磁場強度進行測定，磁場強度范圍為0～30×10-4T連續(xù)可調(diào)（由陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所采用的數(shù)字特拉斯儀測定，陜檢HY9501002號）。本實驗選用輸出為15.38 Hz的準脈沖群，脈沖群的刺激波形為5 ms延時（其中脈沖群為脈沖寬度0.2 ms，脈沖等待0.02 ms；之后60 ms的激發(fā)等待。脈沖上升0.3 μs，脈沖下降2.0 μs）。

圖1 PEMF發(fā)生裝置原理圖Fig.1 Schematic diagram of pulsed electromagnetic field generator

1.4 低壓低氧動物肝臟OS模型建立及分組

標準小鼠常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后，將小鼠隨機分為平原對照組（Control組）、低壓低氧組（HH組）及PEMF干預(yù)組（PEMF組），每組5只。其中Control組置于當(dāng)?shù)睾０胃叨燃s400 m處（西安），將HH組與PEMF組置于低壓低氧艙內(nèi)。為了避免海拔的急劇改變對動物造成的影響，以10 m/s的速度控制海拔的上升和下降，模擬上升至6 000 m。PEMF組施加2 mT磁場干預(yù)，每天干預(yù)2 h。HH組不做任何處理，只暴露于低壓低氧環(huán)境。缺氧處理5 d后，將小鼠處死，迅速解剖分離肝臟組織備用。實驗過程中無小鼠死亡。

1.5 生化檢測

為了測定MDA和抗氧化酶活性，肝臟樣本用0.9%生理鹽水在冰浴中按照100 mg：0.9 mL的比例進行勻漿處理；然后570 g離心10 min，按照試劑盒說明書收集上清液并進行檢測。

對于GSH、GSSG的檢測，同樣將肝臟樣本置于冰浴中，根據(jù)試劑說明按照200 mg：0.8 mL比例進行勻漿；然后1 120 g離心10 min，收集上清液并按照說明書進行檢測。

1.6 蛋白印跡

肝臟組織樣本使用RIPA裂解液在冰上進行裂解30 min，然后進行20 000 g離心，取上清，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行定量。蛋白樣品加入上樣緩沖液后，95℃加熱5 min進行變性處理，然后按照常規(guī)SDS-PAGE方法進行檢測。蛋白條帶采用Quantity One軟件進行定量。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS軟件進行分析。方差齊性檢驗采用Levene檢驗。組間差異比較采用單因素方差分析（F檢驗）及SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEMF對肝臟OS的影響

為了探究PEMF是否可以降低低氧誘發(fā)的肝臟OS水平，本研究檢測了肝臟的MDA、GSH和GSSG水平，如圖2所示。與HH組相比較，PEMF組的MDA和GSSG水平顯著降低，而GSH水平顯著上升。

圖2 PEMF對肝臟OS的影響Fig.2 Effects of pulsed electromagnetic fields on hepatic oxidative stress

2.2 PEMF對肝臟抗氧化酶活性的影響

本研究還對肝臟CAT、SOD以及GSH-Px這3種抗氧化酶活性進行了檢測。結(jié)果顯示，與HH組比較，PEMF組的CAT活性無統(tǒng)計學(xué)差異，SOD活性有上升趨勢，GSH-Px活性顯著上升（P＜0.05），如圖3所示。

圖3 PEMF對肝臟抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of pulsed electromagnetic field on hepatic antioxidant enzyme activity

2.3 PEMF影響肝臟OS的機制

為了進一步探究PEMF改善模擬高原環(huán)境下小鼠肝臟損傷的分子機制，本研究對CAT、SOD1、SOD2和GSH-Px的蛋白表達水平進行了檢測。與HH組比較，PEMF組GSH-Px蛋白表達水平顯著提高，CAT、SOD1和SOD2蛋白表達水平無顯著變化，如圖4所示。

3 討論

圖4 PEMF對CAT、GSH-Px、SOD1和SOD2蛋白表達水平的影響Fig.4 Effects of pulsed electromagnetic fields on expression levels of CAT,GSH-Px,SOD1 and SOD2

高海拔地區(qū)具有低壓低氧等顯著氣候特征，平原機體進入高原后可以通過自身代償適應(yīng)缺氧刺激，但持續(xù)缺氧最終會導(dǎo)致細胞、組織器官等代償超出自身能力范圍，造成線粒體、溶酶體等缺氧損傷?，F(xiàn)有文獻研究表明，高原住民體內(nèi)的氧自由基存在一定程度上的紊亂，主要表現(xiàn)為SOD活性下降，而MDA活性升高，并且這一現(xiàn)象與海拔呈正相關(guān)，這可能是由于高原低壓低氧等特殊環(huán)境因素的影響，致使機體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增多，抗氧化劑SOD的消耗增加，大量氧自由基的長期刺激作用于細胞，最終造成組織細胞的損傷［4］。Irarrázaval等［10］發(fā)現(xiàn)急進高原海拔4 000 m，暴露于低壓低氧環(huán)境易誘發(fā)急性高原反應(yīng)，動脈血氧飽和度下降顯著，暴露24 h后檢測血清OS標志物結(jié)果顯示，MDA活性顯著升高，GSH-Px活性顯著降低。Hefti等［11］將二烯酸等作為OS標記物，通過對海拔490、3 530、4 590和6 210 m的志愿者血液樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)二烯酸等OS標志物顯著上升，并且與海拔高度呈正相關(guān)，表明低壓低氧會導(dǎo)致機體的OS發(fā)生。肝臟作為機體最重要的代謝器官，具有特殊的血供，形成肝內(nèi)的氧分壓梯度代謝，使得肝臟對缺氧極為敏感［12］。既往的實驗研究表明，高原病患者的肝功存在異常，并且與氧自由基存在密切關(guān)系［13-15］。OS損傷是大多數(shù)疾病的病理生理基礎(chǔ)，低壓低氧致使肝臟氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，從而造成肝臟損傷。本研究中，通過模擬海拔6 000 m低壓低氧環(huán)境，對肝臟OS標志物及抗氧化酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，HH組肝臟MDA、GSSG活性顯著升高，而GSH活性顯著降低，預(yù)示OS損傷的發(fā)生；SOD、GSH-Px活性降低，肝內(nèi)抗氧化穩(wěn)態(tài)發(fā)生失衡。這一結(jié)果與Nakanishi等［16］研究結(jié)果基本一致。

電磁場作為一種非電離、非侵入式的安全干預(yù)手段已被FDA所批準。但是電磁場干預(yù)所引起的生物效應(yīng)根據(jù)電磁場的頻率、場強、波形以及刺激時長等參數(shù)的不同，會導(dǎo)致完全不同的結(jié)果［17］。Zhang等［18］對不同波形電磁場作用于成骨細胞進行研究，結(jié)果顯示矩形波電磁場可以有效增加成骨細胞增殖，但降低堿性磷酸酶活性；三角波電磁場可有效提高成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的生成；然而正弦波電磁場顯著抑制成骨細胞增殖，雖然致使堿性磷酸酶的活性升高，但成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成受到顯著抑制；PEMF既促進成骨細胞增殖，又增強了成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成。Seyed等［19］發(fā)現(xiàn)100 μT和500 μT極低頻電磁場會導(dǎo)致大鼠體內(nèi)MDA活性增強。但Wang等［20］的研究結(jié)果卻恰恰相反，PEMF可以提高CAT、SOD活性，通過調(diào)節(jié)改善炎癥和OS來促進受傷脊髓功能恢復(fù)。崔紅等［9］將PEMF作用于db/db小鼠進行干預(yù)，結(jié)果顯示PEMF組肝臟MDA活性顯著降低，GSH含量顯著升高。本研究將PEMF作用于低壓低氧環(huán)境下的小鼠，研究結(jié)果顯示PEMF組降低了低壓低氧誘發(fā)的肝臟OS標志物MDA的活性，降低了GSSG活性，但GSH活性升高，這預(yù)示著PEMF對OS平衡的調(diào)節(jié)。這一結(jié)果與Li等［21］研究結(jié)果相反，可能是由所用電磁場頻率等參數(shù)的不同，電磁場的生物作用效果的窗口效應(yīng)所導(dǎo)致。

為進一步探究PEMF改善肝臟OS的潛在機制，本研究對抗氧化酶蛋白表達進行了檢測，結(jié)果顯示GSH-Px蛋白表達上升，與其活性增強相對應(yīng)；CAT、SOD1和SOD2蛋白表達均無顯著差異。Demirtas等［22］研究發(fā)現(xiàn)，GSH-Px和對氧磷酶活性可以通過單獨攝入一定劑量的褪黑素，以保護大鼠肝臟氧化損傷。GSH-Px作為重要的生理抗氧化劑，保護細胞免受活性氧誘導(dǎo)的氧化損傷［23-24］。本實驗中GSH-Px蛋白響應(yīng)PEMF刺激，表達上升，參與PEMF對OS進行調(diào)控。綜上所述，PEMF會改善小鼠肝臟在模擬高原環(huán)境下的OS反應(yīng)，增強GSH-Px抗氧化活性。下一步，課題組將從細胞水平對PEMF調(diào)控低壓低氧誘發(fā)的OS的機制進行探究。