龔 宇 徐騰鶴 錢(qián)婷婷 羅 穎 陳 浩 趙麗君 吳曉光

(1.承德醫(yī)學(xué)院,承德 067000)(2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，承德 067000)

近年來(lái)抑郁癥的發(fā)病率逐年增高。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，抑郁癥影響到全球約20%的人群，預(yù)計(jì)到2020 年，抑郁癥將在醫(yī)療疾患排名中居第2位[1]。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前的研究未能完全闡明疾病的病因，為特效藥物研發(fā)和臨床治療造成了極大的難度[2]。抑郁癥動(dòng)物模型制作若能相對(duì)簡(jiǎn)單方便、成熟穩(wěn)定，對(duì)于研究其致病機(jī)制和開(kāi)發(fā)抗抑郁藥物具有重要的作用。目前關(guān)于抑郁癥動(dòng)物模型有許多種，如習(xí)得性無(wú)助、慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)、母嬰分離、社會(huì)挫敗等[3]，多采用長(zhǎng)期不可預(yù)見(jiàn)、輕度的應(yīng)激以模擬人在生活中經(jīng)歷的負(fù)性生活事件進(jìn)行造模。許多臨床調(diào)查表明[4]，長(zhǎng)期經(jīng)歷負(fù)性事件是導(dǎo)致抑郁癥的主要危險(xiǎn)因素之一?，F(xiàn)代人們?cè)诿鎸?duì)著逐步加快的生活節(jié)奏和日趨激烈的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，長(zhǎng)期的精神高度緊張成為常態(tài)，而這可能是抑郁癥發(fā)病的重要原因之一。本模型采用長(zhǎng)期驚嚇和睡眠剝奪使小鼠長(zhǎng)期處于精神緊張狀態(tài)，造模后進(jìn)行抑郁行為學(xué)測(cè)試，探究長(zhǎng)期精神緊張與抑郁癥的關(guān)系，為開(kāi)展有關(guān)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及藥物研發(fā)提供動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 J雄鼠小鼠(4周齡)17只，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào): SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均可以自由飲水、攝食，明暗周期為12 h/12 h(8: 00—20: 00)，室溫21～23 ℃，濕度50%～55%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器

小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司)。曠場(chǎng)行為測(cè)試箱，自制(長(zhǎng)×寬×高為50 cm×50 cm×30 cm)。睡眠剝奪箱，自制(長(zhǎng)×寬×高為60 cm×40 cm×30 cm)，中央固定一直徑30 mm平臺(tái)。

1.3 模型建立

將17只雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組7只、長(zhǎng)期精神緊張刺激(LTMS)組10只。LTMS組單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組7只一籠飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)，每周測(cè)定攝食量，刺激實(shí)驗(yàn)之后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。對(duì)LTMS組小鼠采用每天隨機(jī)時(shí)間進(jìn)行貓?bào)@嚇3 h、睡眠剝奪12 h兩種刺激，連續(xù)21 d。睡眠剝奪箱使用60 cm×40 cm×30 cm水箱，水面深度足夠淹沒(méi)小鼠，在中央放置直徑30 mm圓臺(tái)并高出水面0.5 cm，在水箱上方放置有鼠糧的鐵網(wǎng)，以確保小鼠的食物供給。貓嚇操作在直徑1.2米的曠場(chǎng)中，將裝有單只小鼠的鐵籠放在中央，吸引貓對(duì)小鼠驚嚇，為確保貓?jiān)陂L(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中的興趣，實(shí)驗(yàn)前禁食并不定期給予活鼠獎(jiǎng)勵(lì)。

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1攝食量測(cè)定：參考湯球等[5]操作方法，分別于刺激的第0天、第7天、第14天、第21天早上8:00給小鼠添加食物50 g，次日早上8:00稱取每只小鼠的食物殘余量，計(jì)算其24 h攝食量。同時(shí)對(duì)小鼠稱質(zhì)量，以24 h內(nèi)消耗食物量(mg)/體質(zhì)量(g)作為食物消耗量。同籠的小鼠要分開(kāi)孤籠測(cè)量。

1.4.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)檢測(cè)小鼠活動(dòng)度和對(duì)陌生環(huán)境探索的行為程度，水平和垂直運(yùn)動(dòng)的次數(shù)是曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要觀察指標(biāo)[6]。刺激造模21 d之后在安靜、適宜小鼠的環(huán)境中，將小鼠放置于曠場(chǎng)敞箱(50 cm×50 cm×30 cm)底面中心，箱壁四周及底面為白色。底面劃分為9個(gè)等邊方格。曠場(chǎng)觀察實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 min。將小鼠放入中心方格內(nèi)，攝像記錄5 min內(nèi)穿越格數(shù)(以重心越過(guò)為準(zhǔn))，記錄小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)路程、穿越格數(shù)(水平活動(dòng)得分)和前肢均離地或攀壁的直立次數(shù)(垂直活動(dòng)得分)。每次實(shí)驗(yàn)后用75%酒精對(duì)曠場(chǎng)裝置進(jìn)行清理，消除異味。

1.4.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：高架十字迷宮由開(kāi)放臂(30 cm×5 cm)、閉合臂(30 cm×5 cm×15 cm)和兩臂匯合的中央?yún)^(qū)(5 cm×5 cm)組成，距地面50 cm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)[7]，于模型刺激21 d測(cè)試，將小鼠放在中央?yún)^(qū)，面對(duì)開(kāi)臂方向，觀察動(dòng)物在開(kāi)臂和閉臂中的活動(dòng)情況[8]，實(shí)驗(yàn)在暗光、安靜下進(jìn)行，觀察5 min，記錄小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)、開(kāi)放臂停留時(shí)間、進(jìn)入閉合臂次數(shù)和閉合臂停留時(shí)間。

1.4.4強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)主要記錄小鼠在水中放棄掙扎不動(dòng)的時(shí)間，可以較好反映其低落情緒和絕望狀態(tài)[6]。參考Porsolt等[9]的操作方法并根據(jù)具體條件稍作修改，于模型刺激21 d測(cè)試，實(shí)驗(yàn)前為減少小鼠緊張感，提前1 h將小鼠移至安靜的實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠置于直徑15 cm的上方開(kāi)口的透明圓柱形容器之中，水深15 cm，水溫(23±2)℃，持續(xù)6 min，全程通過(guò)攝像機(jī)記錄，統(tǒng)計(jì)后5 min內(nèi)小鼠不動(dòng)的總時(shí)間。每只小鼠實(shí)驗(yàn)后換水并清洗側(cè)壁以防止殘留氣味影響實(shí)驗(yàn)。小鼠在水中確保頭部浮起并停止掙扎或偶爾滑動(dòng)并保持漂浮判斷為不動(dòng)狀態(tài)[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 攝食量變化

結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，第1周攝食量上升，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第14天攝食量下降,無(wú)顯著性差異(P>0.05)，第21天攝食量明顯下降，差異具有極顯著性(P<0.01)。

表1 兩組小鼠食物消耗量Table 1 Two groups of mice food

2.2 行為學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)變化

見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，LTMS組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異具有極顯著性(P<0.01)。曠場(chǎng)試驗(yàn)中，LTMS組小鼠穿越格數(shù)和直立次數(shù)均明顯少于對(duì)照組，差異具有極顯著性(P<0.01)。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，LTMS組小鼠閉合臂停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異具有極顯著性(P<0.01)，開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)占比次數(shù)減少，差異具有顯著性(P<0.05)。

表2 兩組小鼠行為學(xué)指標(biāo)比較Table 2 two groups of mice behavior index

3 討論

抑郁癥是一類以思維遲緩、情緒低落、主動(dòng)性下降和興趣減低等精神運(yùn)動(dòng)性遲滯癥狀為主要表現(xiàn)的心境障礙綜合征[11]。一個(gè)符合臨床表現(xiàn)且穩(wěn)定的抑郁癥模型是研究致病機(jī)制和抗抑郁藥物的重要前提，目前建模的方法很多，如應(yīng)激模型、損傷模型、化學(xué)藥物誘導(dǎo)和基因型改變等。以慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)最常用[12]，但是通過(guò)CUMS最后所得的抑郁癥動(dòng)物模型實(shí)際操作過(guò)程的工作量較大，難以復(fù)制。動(dòng)物模型的衡量標(biāo)準(zhǔn)為表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度，表面效度指模型具有相似的臨床表現(xiàn)，結(jié)構(gòu)效度則是具有相應(yīng)的病理生理學(xué)的改變，而模型的疾病表現(xiàn)可被有效的藥物逆轉(zhuǎn)為預(yù)測(cè)效度[13]。本研究通過(guò)研究長(zhǎng)期精神緊張刺激建立模型，通過(guò)模擬長(zhǎng)期精神打擊來(lái)提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。參照孫秀萍等[14]提出的曠場(chǎng)試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳和高架十字迷宮等抑郁行為實(shí)驗(yàn)方法，觀察動(dòng)物模型在長(zhǎng)期應(yīng)激作用時(shí)是否出現(xiàn)快感缺失、行為絕望和獲得性無(wú)助等情緒表現(xiàn)。從而判斷長(zhǎng)期恐懼所造成的精神緊張?jiān)谝钟舭Y發(fā)病中的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用小鼠對(duì)于貓的恐懼結(jié)合睡眠剝奪刺激造模，模擬出抑郁癥患者長(zhǎng)期精神緊張表現(xiàn)。貓作為小鼠的天敵，在恐嚇實(shí)驗(yàn)中會(huì)造成鼠神經(jīng)行為學(xué)功能退化、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量下降等表現(xiàn)[15]。高江暉等[16]報(bào)道，C57BL/6小鼠在睡眠干擾環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生類抑郁樣行為學(xué)改變，且隨干擾時(shí)間延長(zhǎng)，抑郁癥表現(xiàn)程度也相應(yīng)加重。姚麗華等[17]研究認(rèn)為在抑郁模型中孤養(yǎng)比群居更具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性，本研究結(jié)合貓嚇鼠、剝奪睡眠和孤養(yǎng)造模，相對(duì)于慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激模型的造模時(shí)間長(zhǎng)、勞動(dòng)量大、結(jié)果不穩(wěn)定和難以重復(fù)的缺點(diǎn)[18]，具有造模方法簡(jiǎn)單、易操作的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又模擬了更貼切實(shí)際的精神緊張刺激來(lái)提高模型可信度。

本實(shí)驗(yàn)造模前期，小鼠易激惹、焦躁，反抗性強(qiáng)，造模后期精神萎靡，被毛雜亂無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍。對(duì)比對(duì)照組，LTMS組小鼠應(yīng)激前攝食量差異無(wú)顯著性，在第7天攝食量增加，除了與小鼠處于快速生長(zhǎng)期有關(guān)，前期的精神緊張刺激可能加劇了小鼠攝食量，LTMS組小鼠在第14天之后攝食量減少，在第21天攝食量明顯減少并有顯著性差異。同時(shí)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)也緩慢，提示長(zhǎng)期的貓嚇和睡眠剝奪影響了小鼠進(jìn)食欲望，并導(dǎo)致其生長(zhǎng)遲緩。第28天時(shí)，模型組小鼠被毛暗淡，活動(dòng)性差且外物刺激時(shí)反應(yīng)遲鈍。造模期間3只小鼠死于刺激，死亡率為30%。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中將小鼠放在盛水的圓柱容器內(nèi)，最初在水中表現(xiàn)出劇烈掙扎并試圖逃脫，但當(dāng)發(fā)現(xiàn)無(wú)法逃脫時(shí)便停止掙扎，頭部露出水面保持一種在水中漂浮不動(dòng)的狀態(tài)，此狀態(tài)稱為“行為絕望”[15]。本實(shí)驗(yàn)中，LTMS組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著性延長(zhǎng)，表現(xiàn)出了行為絕望狀態(tài)。曠場(chǎng)試驗(yàn)中，小鼠穿越水平格數(shù)和站立次數(shù)可以反映活動(dòng)度和探究行為[19]。LTMS組小鼠穿越格子數(shù)(水平運(yùn)動(dòng))和直立次數(shù)(垂直運(yùn)動(dòng))較對(duì)照組明顯減少，反映了小鼠的活動(dòng)度降低和對(duì)新鮮環(huán)境的探索欲望降低。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，小鼠在與外界環(huán)境相通的開(kāi)臂中會(huì)有一定的新奇性和探索欲望，小鼠由于嗜暗性會(huì)傾向于在閉臂中活動(dòng)，但出于好奇心和探究性又會(huì)在開(kāi)臂中活動(dòng)[20]。焦慮抑郁水平高的小鼠會(huì)退縮到閉臂中，反之對(duì)開(kāi)臂的探究次數(shù)則增多[21]。本研究結(jié)果顯示，LTMS組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)比例顯著下降，且在閉臂時(shí)間顯著增加，提示產(chǎn)生焦慮行為。

綜上所述，長(zhǎng)期精神緊張刺激模型表現(xiàn)出的行為絕望、活動(dòng)能力下降、興趣喪失和焦慮與抑郁癥臨床表現(xiàn)相似，且結(jié)合孤養(yǎng)模擬了抑郁癥發(fā)病的常見(jiàn)因素，成功地建立了符合表面效度的小鼠抑郁模型。