HPLC法測(cè)定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿的含量

潘遐 才讓草 李魁 高曉昱 才讓三知 張騫

【摘 要】目的：建立高效液相色譜法測(cè)定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿含量的方法。方法：采用HPLC法對(duì)制劑中石榴子和訶子的鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定;采用HPLC法對(duì)制劑中蓽茇的胡椒堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：鞣花酸在5.065～25.325 μg呈良好線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率為98.2%，RSD=2.8%（n=6）;胡椒堿在10.414～52.071 μg呈良好線性關(guān)系（r=1.0000），平均回收率為99.4%，RSD=1.1%（n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可有效控制石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿成分的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】石榴蓮花散;鞣花酸;胡椒堿;含量測(cè)定;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A?【文章編號(hào)】1007-8517（2019）19-0037-05

Abstract： Objective To establish a HPLC method for the determination of ellagic acid and piperine in Tibetan medicine garneta powder. Methods The content of ellagic acid in pomegranate and terminalia fruit was determined by HPLC. HPLC method for preparation of piper Ba piperine content determination. Results Ellagic acid showed a good linear relationship at 5.065 ～ 25.325 μg （r=0.9999）， with an average recovery of 98.2% and RSD=2.8%（n=6）. Piperine showed a good linear relationship in 10.414～52.071 μg （r=1.0000）， with an average recovery of 99.4% and RSD=1.1%（n=6）. Conclusion The method is simple， accurate， reproducible， highly specific and reliable. It can effectively control the quality of ellagic acid and piperine in pomegranate pollen .

Key?words：Pomegranate lotus powder; Ellagic acid;Piperine; Content determination; High performance liquid chromatography

民族醫(yī)藥學(xué)是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，藏醫(yī)藥是我國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)中的瑰寶之一，在藏族人民的防病治病中發(fā)揮了不可磨滅的作用，以其獨(dú)特的療效越來越被大家關(guān)注。石榴蓮花散由石榴子、肉桂、豆蔻、蓽茇、波棱瓜子、黑冰片（炭）、訶子、薔薇花八味中藏藥材組成，具有溫中健胃，消食[1]的功效，用于“培根甲布”病，積食不化，“赤巴”病，“木布”病，胃腸傳染病等[2]。從藏成藥發(fā)展概況及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究存在的局限性和相關(guān)問題、方劑理論在藏成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的指導(dǎo)意義進(jìn)行探討。當(dāng)前藏藥標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)相對(duì)比較滯后，導(dǎo)致藏藥材生產(chǎn)、加工、管理過程不規(guī)范、不統(tǒng)一，優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、有效、可控的藏藥材原料供給不足，嚴(yán)重制約了我省藏成藥產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)整體轉(zhuǎn)型升級(jí)和提質(zhì)增效。藏成藥石榴蓮花散現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥第一冊(cè)）》（1995年版），但該標(biāo)準(zhǔn)中只有【性狀】和【檢查】項(xiàng)[3]，缺乏【鑒別】、【含量測(cè)定】項(xiàng)目，不能有效控制各組成成分的質(zhì)量，從而不能有效控制藏藥制劑的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)方法采用HPLC法對(duì)制劑中石榴子和訶子中鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定，采用HPLC法對(duì)制劑中蓽茇的胡椒堿進(jìn)行含量測(cè)定，從而更加有效的控制藏成藥石榴蓮花散的質(zhì)量。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?Agilent1260高效液相色譜儀（配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器），Agilent1260高效液相色譜儀（配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器），Mettler toledo MS205-DU電子分析天平，MettlertoledoEL204-IG電子分析天平，Olympus BX43 CX31光學(xué)顯微鏡， GT SONIC-L30超聲波清洗器（廣州固特超聲有限公司）。

1.2?試藥鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)：11959-201602，含量以89.3%計(jì)）、胡椒堿對(duì)照品（批號(hào)：110775-201706，含量以98.9%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇為色譜純（德國(guó)默克公司）;水為屈臣氏蒸餾水;其它所用試劑為分析純。石榴蓮花散樣品10批（來源：甘南藏族自治州藏醫(yī)藥研究院4批S1，S2，S3，S4，甘肅省夏河縣藏醫(yī)院3批S5，S6，S7，甘肅省碌曲縣西倉(cāng)寺院藏醫(yī)院3批S8，S9，S10）。

2?方法與結(jié)果

2.1?鞣花酸的含量測(cè)定

2.1.1?對(duì)照品溶液的制備?精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量，加甲醇制成 253.2548 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2?供試品溶液的制備?精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇，稀釋、定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3?陰性對(duì)照溶液的制備?按本品處方及制備工藝制得缺石榴子和訶子的陰性樣品，照“2.1.2”項(xiàng)供試品制備方法處理，即得缺石榴子和訶子的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4?色譜條件與系統(tǒng)適用性[4-6]色譜柱：Agilent 5 HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（15∶85）;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;進(jìn)樣量10 μL;體積流量：1.0 mL/min;柱溫30 ℃。

2.1.5?專屬性試驗(yàn)?分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上則未檢測(cè)到峰，對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，見圖1。

2.1.6?線性關(guān)系考察?分別精密吸取上述“2.1.1”對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、5mL于50 mL量瓶中，2 mL于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”相色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=108.45X-118.17（r=0.999 9），5.065～25.325μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7?精密度試驗(yàn)?精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.1.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定鞣花酸峰面積，計(jì)算其RSD=0.38%（n=6），表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.1.8?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取供試品溶液（樣品S2），按含量測(cè)定方法分別在0、2、4、6、8、12 h測(cè)定其鞣花酸含量。結(jié)果6次測(cè)定鞣花酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3130%，RSD=1.29%（n=6）。結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9?重復(fù)性試驗(yàn)取?同一批樣品（樣品S2），按“2.1.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定其鞣花酸含量。結(jié)果6份供試品中鞣花酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.290%，RSD=1.28%（n=6）。結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.10?加樣回收率試驗(yàn)?取已知鞣花酸含量的同一批樣品0.4 g（樣品S2），精密稱定，平行6份，分別精密加入鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（253.2548 μg/mL）5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在2.1.4色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該含量測(cè)定方法的加樣回收率符合要求。

2.1.11?樣品含量測(cè)定?取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及鞣花酸對(duì)照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”色譜條件下測(cè)定鞣花酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

2.2?胡椒堿的含量測(cè)定[7-8]2.2.1?對(duì)照品溶液的制備?精密稱取胡椒堿對(duì)照品適量置棕色容量瓶中，加甲醇制成 104.1417 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2?供試品溶液的制備[9]精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3?陰性對(duì)照溶液的制備?按本品處方及制備工藝制得缺蓽茇的陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)供試品制備方法處理，即得缺蓽茇的陰性對(duì)照溶液。

2.2.4?色譜條件與系統(tǒng)適用性?色譜柱：Agilent 5 HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（40：60）;檢測(cè)波長(zhǎng)：343 nm;進(jìn)樣量10 μL;體積流量：1.0 mL/min;柱溫30 ℃。

2.2.5?專屬性試驗(yàn)?分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上則未檢測(cè)到峰，對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，見圖2。

2.2.6?線性關(guān)系考察?分別精密吸取上述“2.2.1”對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、5 mL于50 mL棕色容量瓶中，取2 mL于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”相色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=72.128X-0.5195（r=1.000 0），10.414～52.071μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7?精密度試驗(yàn)?精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.2.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定胡椒堿峰面積，計(jì)算其RSD=0.42%（n=6），表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.2.8?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取供試品溶液（樣品S3），按含量測(cè)定方法分別在0，2，4，6，8，12 h測(cè)定其胡椒堿含量。結(jié)果6次測(cè)定胡椒堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.121%，RSD=0.22%（n=6）。結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批樣品（樣品S3），按“2.2.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定其胡椒堿含量。結(jié)果6份供試品中胡椒堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.119%，RSD=0.58%（n=6）。結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.10?加樣回收率試驗(yàn)?取已知胡椒堿含量的同一批樣品0.4 g（樣品S3），精密稱定，平行6份，分別精密加入胡椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（104.1417 μg/mL）5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該含量測(cè)定方法的加樣回收率符合要求。

2.2.11?樣品含量測(cè)定?取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及胡椒堿對(duì)照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見表2。

3?討論

方法選定過程中，石榴蓮花散方中8味藥，石榴子為主藥，通過查閱大量文獻(xiàn)資料顯示，石榴子中主要特征成分有石榴酸，鞣花酸等，但石榴酸是共軛三烯酸，其性質(zhì)不穩(wěn)定，存在同分異構(gòu)體，易氧化成醛、酮、酸、醇和環(huán)氧化物等易揮發(fā)的小分子物質(zhì)，且已有大量文獻(xiàn)研究采用HPLC法測(cè)定石榴籽中鞣花酸等鞣質(zhì)成分的含量[10]，色譜條件成熟，訶子中主要特征成分也有鞣花酸，故本實(shí)驗(yàn)選擇研究具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等藥理作用的鞣花酸為對(duì)照，進(jìn)行其含量測(cè)定，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)用甘南州藏醫(yī)院提供的單味藥材模擬石榴蓮花散配方制成自配樣，用建立的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定自配樣和石榴子、訶子單味中的鞣花酸含量，結(jié)果表明，自配樣中鞣花酸含量為石榴子和訶子單味中的總和。因此考慮建立高效液相色譜方法同時(shí)測(cè)定石榴子與訶子中鞣花酸的含量 。

過程中應(yīng)注意，蓽茇中主要活性化學(xué)成分是胡椒堿，其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用。胡椒堿對(duì)光十分敏感，易發(fā)生光化學(xué)歧化作用產(chǎn)生異構(gòu)體。因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定蓽茇中胡椒堿的含量時(shí)，在取樣后加入溶媒超聲提取、過濾、稀釋等實(shí)驗(yàn)操作過程中要特別注意避光，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)被測(cè)成分鞣花酸、胡椒堿的純度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與對(duì)照品光譜圖一致，說明被測(cè)峰基本為單一物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)供試品溶液的制備方法中，供試品超聲提取時(shí)間的選擇試驗(yàn)了30min、40min、50min，超聲時(shí)間30min的待測(cè)成分含量較低，超聲時(shí)間40min和50min的待測(cè)成分含量較高，且相差不大，表明超聲40min待測(cè)成分已基本提取完全，因此選擇超聲提取時(shí)間為40min。

綜上，在現(xiàn)有試驗(yàn)條件下，本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法測(cè)定鞣花酸和胡椒堿含量的方法，供試品制備前處理操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可有效控制藏成藥石榴蓮花散的質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-07-23?編輯：劉斌）