當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

唐靖雯 盧禮平 李嬌嬌 楊桃 潘梅

【摘 要】目的：建立當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。方法：采用薄層色譜法對(duì)制劑中當(dāng)歸、川芎、甘草、黃芪、白芍進(jìn)行定性鑒別，以白芍中芍藥苷作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量。色譜柱為Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶ 88），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：當(dāng)歸、川芎、甘草、黃芪、白芍的TLC法鑒別專屬性強(qiáng)，且陰性均無(wú)干擾;含量測(cè)定結(jié)果顯示，芍藥苷濃度在（4.38～140.16）μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9998），平均加樣回收率為99.45%，RSD=1.97%（n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型）的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型）;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜法;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）20-0040-05

Abstract：Objective The quality standard of Angelica regulating granule （sugar-free type） was established to effectively control the quality of products.Methods TLC was used to identify the radix angelicae sinensis， rhizoma chuanxiong， radix glycyrrhiza root， radix astragalus root and radix paeoniae alba. The content of paeoniflorin in radix paeoniae alba was determined by HPLC. The column was Agilent TC-C18（250 mm×4.6mm，5μm）， the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （12∶ 88， V/V）， the flow rate was 1.0mL/min， the detection wavelength was 230nm， the column temperature was 25℃， and the injection volume was 10μL.Results The TLC method of angelica sinensis， ligusticum chuanxiong， licorice root， astragalus root and paeoniae alba has strong specificity and no interference. The results showed that the concentration of paeoniflorin in （4.38 ～ 140.16）μg/mL had a good linear relationship with the peak area （r=0.9998）， and the average recovery rate was 99.45%， RSD=1.97% （n=6）.Conclusions The method is simple， accurate， specific and repeatable， and can be used for the quality control of Angelica regulating granule （sugar-free type）.

Keywords：Angelica regulating granule（sugar-free type）;Quality standards;TLC;HPLC

當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒由當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草、黃芪等7味藥材組成，收載入《中國(guó)藥典》2015年版。具有補(bǔ)血助氣、調(diào)經(jīng)的功效，用于貧血衰弱、病后、產(chǎn)后血虛以及月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)。本研究在當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒含糖型基礎(chǔ)上，完成了其無(wú)糖型產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究并建立了企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為廣大患者提供了一個(gè)治療痛經(jīng)的產(chǎn)品。為保證臨床用藥的安全、有效以及更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法對(duì)制劑中當(dāng)歸、川芎、甘草、黃芪、白芍等5味藥材進(jìn)行定性鑒別;建立了以制劑中白芍的主要活性成分芍藥苷為指標(biāo)性成分的HPLC含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、ChemStation色譜工作站、1200型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）;AG135型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;CH-250型超聲波清洗機(jī)（天津恒奧科技公司，功率：250W，頻率：40KHz）;硅膠G（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20150701）。

1.2 藥品與試劑 無(wú)糖型當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（批號(hào)：170501、170502、170503，貴州威門藥業(yè)股份有限公司）;芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201741，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;磷酸（批號(hào)：10015408，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;乙腈為色譜純;乙酸乙酯、三氯甲烷、冰醋酸、環(huán)己烷、無(wú)水乙醇均為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 當(dāng)歸、川芎的鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加水30 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次（水液備用），每次使用20mL，將兩次乙醚提取液合并，揮干乙醚提取液，殘?jiān)觢mL甲醇使完全溶解，作為供試品溶液。分別取當(dāng)歸、川芎藥材，按照供試品溶液的制備方法分別制成當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材溶液。另按制劑的處方比例稱取適量缺當(dāng)歸、川芎藥材的其他各味藥材，按該制劑的制備工藝制成顆粒，取顆粒適量，按上述制備供試品溶液的操作方法制成缺當(dāng)歸、川芎藥材的陰性樣品。照薄層色譜法（2015年版中國(guó)藥典四部，通則0502），分別依次吸取上述當(dāng)歸對(duì)照藥材、川芎對(duì)照藥材、陰性樣品、供試品溶液各4μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶ 1∶ 1∶ 0.1）的溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果，當(dāng)歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。如圖1所示。

2.1.2 甘草的鑒別 取本品10g，研細(xì)，加乙醚40mL，超聲處理30min，濾過(guò)，棄去乙醚液，殘?jiān)鼡]干乙醚，加水40mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状糽mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草藥材及缺甘草的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法分別制成甘草對(duì)照藥材溶液、缺甘草的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國(guó)藥典四部，通則0502），分別吸取上述甘草對(duì)照藥材、陰性樣品、供試品溶液各6μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶ 1∶ 1∶ 2）的溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果，當(dāng)歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，且陰性無(wú)干擾。如圖2所示。2.1.3 黃芪的鑒別 取“2.1.1”項(xiàng)下的備用水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状糽 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每lmL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國(guó)藥典四部，通則0502），分別吸取上述黃芪苷對(duì)照品、陰性樣品、供試品溶液各6μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用三氯甲烷-甲醇-水（13∶ 7∶ 2）的下層溶液作為展開(kāi)劑，取出硅膠板后放置晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別在日光及紫外光（365nm）下檢視。結(jié)果，黃芪的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。如圖3、圖4所示。

2.1.4 白芍的鑒別 取本品10g，加乙醇10mL，振搖5min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖糽mL使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每lmL含lmg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺白芍的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國(guó)藥典四部，通則0502），分別吸取上述芍藥苷對(duì)照品、陰性樣品、供試品各10μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠薄層板，選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶ 5∶ 10∶ 0.2）為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出硅膠板后放置晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，白芍的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，與芍藥苷對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。如圖5所示。

2.2 芍藥苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）;乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶ 88，V/V）;流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;柱溫：25℃;進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液[2] 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，從中取約2.5 g藥物粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL使溶解，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL含35 μg的溶液，既得。

2.2.2.3 缺白芍的陰性樣品 按處方稱取缺白芍的群藥，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[3-5] 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺白芍的陰性樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算>3000，分離度>1.5。色譜如圖6所示。

2.2.4 線性關(guān)系 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成0.2192mg/mL的溶液，分別精密量取0.5、1、2、4、8、16μL至25mL的容量瓶中，加甲醇稀釋刻度。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以各對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程：A= 14.254C-25.694，r=0.9998。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液濃度在（4.38～140.16）μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)170501），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄芍藥苷的峰面積。結(jié)果，峰面積RSD為0.28%，表明儀器精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)170501），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣測(cè)定記錄色譜峰。結(jié)果，峰面積的RSD為1.72%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)170501）6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芍藥苷的含量。結(jié)果，含量的RSD為1.96%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知芍藥苷含量的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型，批號(hào)：170501，含量為0.3427mg/g），采用加樣回收法，測(cè)定本方法的回收率。精密稱取本批次當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒1.25g，分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液（35.20μg/mL）10 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，計(jì)算白芍苷的加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品含量的測(cè)定 取3批樣品（批號(hào)170501、170502、170503）各適量，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL注入HPLC儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖;另取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品的含量，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

3 討論

研究對(duì)制劑中當(dāng)歸、川芎進(jìn)行TLC 定性鑒別時(shí)，按照文獻(xiàn)方法：分別用正己烷-乙酸乙酯（9∶ 1）、正己烷-乙酸乙酯（4∶ 1）作為展開(kāi)劑進(jìn)行TLC定性鑒別，結(jié)果供試品色譜中均未顯示斑點(diǎn)。在多次嘗試的基礎(chǔ)下發(fā)現(xiàn)，以兩種溶劑作為展開(kāi)劑時(shí)始終無(wú)法獲得理想的展開(kāi)效果，故最終選擇采用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶ 1∶ 1∶ 0.1）的4種溶劑作為展開(kāi)劑，所得的供試品色譜中斑點(diǎn)也較為清晰。

制劑中當(dāng)歸、白芍的主要活性成分分別為阿魏酸、芍藥苷，在含量測(cè)定的指標(biāo)性成分如何選取過(guò)程中，考慮到君藥當(dāng)歸中阿魏酸含量較低，故選擇含量較高、成分較穩(wěn)定的活性成分芍藥苷作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法測(cè)定白芍中芍藥苷的含量。但由于中藥制劑成分復(fù)雜且該制劑中白芍所占比例小等因素，僅以白芍中芍藥苷作為指標(biāo)性成分來(lái)控制該制劑質(zhì)量明顯不足，因此在后續(xù)的研究中，應(yīng)優(yōu)化臣藥中阿魏酸的提取方法，增加制劑中阿魏酸提取量，建立多指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法，以更有效地控制該制劑的質(zhì)量。

綜上，本研究建立的質(zhì)量控制分析方法，經(jīng)過(guò)對(duì)多批產(chǎn)品的驗(yàn)證，結(jié)果表明該質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒（無(wú)糖型）生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制，能有效地保證產(chǎn)品臨床用藥的安全性、有效性和可控性。

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（收稿日期：2019-08-29 編輯：陶希睿）