胡 丹，尹 明，曹 紅，單婷婷，張貴英

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)總站 北京100166；2.解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心急診科 北京 100853)

舒肝和胃丸是由醋香附、白芍等十三味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，用于肝胃不和、兩肋脹滿等。該品種是《中國(guó)藥典》2015年版一部品種，原檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置較全面，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)，將薄層部分進(jìn)行優(yōu)化、整合，增加了木香、佛手和陳皮藥材的TLC鑒別。文獻(xiàn)[1-3]只有芍藥苷、橙皮苷單純的指標(biāo)性含量測(cè)定的方法，不能全面反映藥品的質(zhì)量。文獻(xiàn)[4-9]表明白芍總苷( TGP) 是白芍的有效部位，含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin)等一系列單萜糖苷類化合物。已經(jīng)證明白芍總苷的藥理作用多樣，其中芍藥內(nèi)酯苷為白芍的特征性成分，在補(bǔ)血、抗抑郁、糖尿病潛在治療方面優(yōu)于芍藥苷；1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖有良好的抗腫瘤效果。去甲異波爾定屬于異喹啉生物堿，是中藥材烏藥的主要藥效之一，具有較強(qiáng)的藥理活性，針對(duì)關(guān)節(jié)炎也有很好的療效；橙皮苷是一種天然的二氫黃酮苷，屬黃烷酮類化合物，是陳皮和佛手的主要活性成分之一且性質(zhì)穩(wěn)定，在該方劑中含量較高?？紤]到上述幾種成分較強(qiáng)的藥理學(xué)作用和含量較高等原因，測(cè)定單一成分難以反映藥材整體質(zhì)量，故嘗試建立了HPLC法測(cè)定同一供試品溶液中去甲異波爾定、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖與橙皮苷5種成分的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀Agilent 1200(美國(guó)，含DAD檢測(cè)器)；電子天平XS-205DU(METTLER TOLEDO)；超聲波清洗器KQ-300E(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

對(duì)照品：去甲異波爾定(批號(hào)：111825-201402，95.7%)，芍藥苷(批號(hào)：110752-200912，98.7%)，橙皮苷(批號(hào)：110721-201316，95.1%)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)：76610010，98.72%)1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(批號(hào)：76620010，99.39%)均購(gòu)于上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司

對(duì)照藥材： 木香(批號(hào)：120921-201309)；陳皮(批號(hào)：120921-201309)；白芍(批號(hào)：120905-201109)；佛手(批號(hào)：120933-201405)；均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。

試劑：乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

藥品：舒肝和胃丸水蜜丸(A企業(yè)，批號(hào)16032993)；(B企業(yè)，批號(hào)160303)；(C企業(yè)，批號(hào)20160502)；均為9g/丸。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1木香、佛手

取本品水蜜丸5 g，研碎，加入石油醚(30℃～60℃)約60 ml，靜置30 min，超聲30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。取木香、佛手對(duì)照藥材各1 g，加石油醚(30℃～60℃)10 ml，分別按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。另按處方量分別制備缺木香、佛手的陰性對(duì)照品溶液。按薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述4種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲苯(1∶15)為展開劑，展開，取出，晾干。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)(木香)。在紫外(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)(佛手)。陰性無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 木香薄層色譜圖 (青島海洋板，溫度：23℃ 相對(duì)濕度：35%) 1～3(S1～S3).供試品；4.木香藥材；5.缺木香陰性對(duì)照； 6.佛手藥材；7.缺佛手陰性對(duì)照

取本品水蜜丸7g，研碎。加甲醇50ml，回流1 h，濾過(guò)，取濾液1ml作為供試品溶液，其余備用。另取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。另按處方量分別制備缺陳皮和佛手的陰性對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)，吸取上述3種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(28∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 橙皮苷薄層色譜圖 (青島海洋板，溫度：23℃ 相對(duì)濕度：35%)1.陰性對(duì)照品；2.對(duì)照品；3～5(S1～S3).供試品

2.2 含量測(cè)定

2.2.1色譜條件

色譜柱： CAPCELL PAK C18(5 μm ,4.6 mm×250 mm )；流動(dòng)相：0.2%磷酸 (A)-乙腈(B) (v/v)；采用梯度洗脫，程序如下：0～30 min，10% B；31～45 min，11%～15% B；46～59 min，16%～19% B；60～74 min，20%～21% B，流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：10 μl；

2.2.2對(duì)照品溶液的制備

取去甲異波爾定、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 ml含去甲異波爾定3 μg、芍藥內(nèi)酯苷10 μg、芍藥苷15 μg、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖4 μg、橙皮苷10 μg的混合溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備

①由經(jīng)治醫(yī)生檢查,簽訂手術(shù)同意書,做好手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。②手術(shù)前應(yīng)該預(yù)防感冒、腹瀉等問(wèn)題。保持大小便通暢。咳嗽、咳痰患者不宜手術(shù)。③為確保無(wú)菌,避免感染,手術(shù)中病人口鼻須遮蓋手術(shù)巾,部分患者會(huì)有胸悶等不適感,可用毛巾遮蓋口鼻30分鐘進(jìn)行適當(dāng)練習(xí),每日2次。

取本品水蜜丸研細(xì)，取約0.55g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4專屬性試驗(yàn)

按處方工藝，分別制備缺烏藥、佛手、陳皮、白芍的陰性對(duì)照樣品。按供試品溶液的制備方法制成各自陰性對(duì)照溶液。分別吸取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、5種陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(見(jiàn)圖4)，樣品中去甲異波爾定、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、橙皮苷峰與其他組分色譜峰能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不得低于3 000，陰性對(duì)照液中色譜峰測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.5線性關(guān)系考察

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20μl注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。去甲異波爾定、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、橙皮苷的回歸方程，呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的舒肝和胃丸(批號(hào)16032993)的樣品6份，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量，結(jié)果顯示，去甲異波爾定平均含量為0.11 mg/g，RSD為1.83%；芍藥內(nèi)酯苷平均含量為0.21mg/g，RSD為1.06%；芍藥苷平均含量為0.63mg/g， RSD為1.65%；1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖平均含量為0.14mg/g，RSD為1.33%；橙皮苷平均含量為1.01mg/g，RSD為1.31%。表明方法的重復(fù)性較好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的舒肝和胃丸(批號(hào)16032993)的樣品，照“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，精密吸取10 μl，分別在0、4、10、16、22、30 h內(nèi)進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果去甲異波爾定、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、橙皮苷峰面積的 RSD分別為1.98%、1.25%、1.44%、1.35%、1.44%。結(jié)果表明，舒肝和胃丸的供試品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定，表明該方法有良好的穩(wěn)定性。

圖4 舒肝和胃丸專屬性HPLC圖譜 A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺佛手陰性對(duì)照溶液； D.缺陳皮陰性對(duì)照溶液；E.缺烏藥陰性對(duì)照溶液; F.缺白芍陰性對(duì)照溶液；G.缺佛手、陳皮、烏藥、白芍的陰性對(duì)照溶液 1.去甲異波爾定(烏藥)；2.芍藥內(nèi)酯苷(白芍)；3.芍藥苷(白芍)； 4.1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(白芍)；5.橙皮苷(佛手、陳皮)

2.2.8加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)的舒肝和胃丸(批號(hào)16032993)的樣品0.275 g，精密稱定，精密加入去甲異波爾定(0.001 28 mg/ml)、芍藥內(nèi)酯苷(0.002 4 mg/ml)、芍藥苷(0.007 2 mg/ml)、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(0.001 64 mg/ml)、橙皮苷(0.016 mg/ml)混合對(duì)照品溶液25 ml，按上述方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定其含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.9樣品測(cè)定

按上述方法，制備供試品溶液，依相同色譜條件，以外標(biāo)法計(jì)算，測(cè)定3個(gè)企業(yè)的水蜜丸樣品的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 5個(gè)對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

表2 舒肝和胃丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 舒肝和胃丸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜

參照藥典[1]，修訂了原方法中佛手的薄層鑒別方法，在此基礎(chǔ)上又同時(shí)鑒別木香的TLC法，效果較好，故采用同一供試品溶液分別在日光(鑒別木香)和紫外光(鑒別佛手)下鑒別兩種藥材。其次，陳皮當(dāng)中含有橙皮苷成分，且佛手藥材中也含有少量的橙皮苷，故同時(shí)建立兩者的橙皮苷的TLC法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考文獻(xiàn)[4-6]5種成分當(dāng)中有3種成分(芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖)均為白芍藥材的成分，其余2種成分(去甲異波爾定、橙皮苷)，經(jīng)紫外吸收光譜掃描發(fā)現(xiàn)最大吸收均為280 nm，考慮到兩者的響應(yīng)值較高，且5種成分在 230 nm處吸收值相對(duì)較好，綜合考慮，最終確定230 nm作為同時(shí)測(cè)定5種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法及溶劑選擇

按照中國(guó)藥典[1]中測(cè)定芍藥苷含量的方法，以芍藥苷峰面積為指標(biāo)考察回流提取法和超聲提取法對(duì)芍藥苷的提取效率的影響，結(jié)果顯示，回流與超聲無(wú)明顯差異，且回流后樣品黏性大、雜質(zhì)多，較難過(guò)濾，容易損壞色譜柱，最終選擇超聲提取法。分別采用不同濃度的甲醇、乙醇為溶劑提取樣品，最終選取稀乙醇作為供試品溶液的提取溶劑條件。考察了供試品于15、30、45和60 min不同超聲時(shí)間的提取結(jié)果。結(jié)果顯示，30 min后芍藥苷的相對(duì)峰面積不再增加，最終選擇超聲30 min作為提取方法。

3.4 流動(dòng)相選擇

中國(guó)藥典[1]采用的緩沖鹽作為流動(dòng)相，對(duì)儀器損傷較大，嘗試用乙腈和0.2%磷酸水、甲醇和0.2%磷酸水、乙腈和水3種試驗(yàn)方法，結(jié)果顯示，乙腈和0.2%磷酸水溶液的梯度洗脫的流動(dòng)相最為理想，實(shí)現(xiàn)了5種成分與相鄰各峰達(dá)到有效分離，最終采用該方法，實(shí)現(xiàn)節(jié)約成本，達(dá)到簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的效果。

綜上所述，本研究修訂了原薄層方法，并建立了“一板多測(cè)”的TLC方法和“同一供試品溶液測(cè)定多種成分”的HPLC法，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、準(zhǔn)確等明顯優(yōu)勢(shì)，中藥多組分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制為生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)部門更加全面的檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此作為提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以全面控制該品種的質(zhì)量。