黃小珍，熊 順，傅麗容，史海濤

( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，海南 ?？?571158 )

近年來龜鱉養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，已逐漸成為我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)[1]。在規(guī)模化、集約化龜鱉養(yǎng)殖過程中，極易受到環(huán)境、飼料營養(yǎng)組成、飼養(yǎng)管理等方面影響而導(dǎo)致應(yīng)激的產(chǎn)生，如脅迫應(yīng)激、溫度應(yīng)激和抓捕應(yīng)激等[2]。任何較強應(yīng)激都會伴隨氧化應(yīng)激的發(fā)生[3]，氧化應(yīng)激嚴(yán)重影響水產(chǎn)動物繁殖、生產(chǎn)性能和健康，降低經(jīng)濟效益。

已有的研究表明氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧在細胞內(nèi)積聚，機體氧化和抗氧化能力失衡，自由基在體內(nèi)積累引發(fā)機體許多臟器的損傷[4]。睪丸作為生殖系統(tǒng)的重要器官，其內(nèi)部生殖細胞對細胞內(nèi)外的氧化狀態(tài)高度敏感，極易受到自由基的傷害，內(nèi)源性和外源性物質(zhì)均可影響其發(fā)育和功能[5-6]。因此養(yǎng)殖龜鱉繁殖能力下降、性比失調(diào)等問題已引起廣泛的關(guān)注。

應(yīng)用營養(yǎng)性體內(nèi)抗氧化劑最大程度降低動物生產(chǎn)中的氧化應(yīng)激損害，是目前公認(rèn)綠色、環(huán)保有效的生產(chǎn)方法。酵母多糖是酵母細胞壁的重要組成部分，是促進動物生長、調(diào)節(jié)動物腸道、增強免疫功能的新型水產(chǎn)飼料添加劑[7-8]。有研究表明，飼料中添加1200 mg/kg的酵母多糖可明顯提升中華條頸龜(Mauremyssinensis)幼龜?shù)姆翘禺愋悦庖邫C能[9]。孫翠慈[10]研究了酵母多糖對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)抗氧化作用。而酵母多糖在龜鱉養(yǎng)殖中的抗氧化作用卻鮮見研究，本研究擬開展氧化應(yīng)激對雄性紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)生殖器官的影響，分析氧化損傷的作用機制，并探討飼料添加酵母多糖抗應(yīng)激效應(yīng)，為龜鱉養(yǎng)殖探尋更為有效的抗氧化應(yīng)激方式。

1 材料與方法

1.1 試驗龜、藥品及飼養(yǎng)條件

試驗用32只健康成體雄性紅耳龜，體質(zhì)量為(387.4±49.5) g，購自海口市鴻旺水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。置海南師范大學(xué)龜養(yǎng)殖中心馴養(yǎng)，養(yǎng)殖池規(guī)格為190 cm×65 cm×32 cm，水深沒過背甲，光照度100 lx，溫度(30±2) ℃，每池飼養(yǎng)8只。所用飼料為佛山市順德區(qū)全興水產(chǎn)飼料有限公司生產(chǎn)的龜鱉配合飼料(粗蛋白≥43.0%，粗纖維≤3.0%，鈣1.0%～3.5%，總磷0.8%～3.0%，氯化鈉1.2%～3.5%，賴氨酸≥2.0%，水分≤12.0%)，試驗過程中每2 d投喂1次，投飼量以使其達到飽食并略有剩余為準(zhǔn)，投喂2 h后清理剩余飼料。

酵母多糖為購自湖北安琪酵母有限公司的福邦牌免疫多糖(酵母細胞壁多糖)，各成分含量：β-葡聚糖30%～40%、甘露寡糖≥20%、幾丁質(zhì)≥2.5%、蛋白質(zhì)≤35%、水分≤6.0%、溶解率45%～60%、30% H2O2(廣州化學(xué)試劑廠500 mL，加無菌雙蒸水配制為10% H2O2)。

1.2 氧化應(yīng)激模型制備

為了更準(zhǔn)確地掌握氧化應(yīng)激對雄性紅耳龜睪丸的損傷作用，預(yù)試驗分5個劑量梯度(按體質(zhì)量腹腔注射0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/kg的10% H2O2溶液)[11]，每組6只，于后肢基部靠近睪丸部位腹腔注射，每只保持注射深度、方向一致，次日睪丸取樣制作組織切片。鏡檢結(jié)果顯示，自注射劑量1.5 mL/kg開始，紅耳龜睪丸曲細精管生精上皮出現(xiàn)明顯的氧化損傷。因此，本試驗按1.5 mL/kg注射10% H2O2制備睪丸氧化應(yīng)激模型。

1.3 試驗設(shè)計

試驗紅耳龜隨機分為4組，每組2個平行，每個平行4只龜，各組間試驗龜體質(zhì)量均一。試驗第1 d對其中3組紅耳龜按照1.5 mL/kg進行腹腔一次性注射10%H2O2，剩余1組(對照組)注射等量無菌生理鹽水。對照組(生理鹽水非應(yīng)激處理)、試驗組1(應(yīng)激處理組)，腹腔注射10%H2O21 d后取樣。試驗組2(基礎(chǔ)日糧投喂組)、試驗組3(酵母多糖添加組)第1 d同樣注射10% H2O2，飼喂30 d后取樣；基礎(chǔ)日糧投喂組僅投喂基礎(chǔ)日糧，酵母多糖添加組以基礎(chǔ)日糧按體質(zhì)量1200 mg/kg添加酵母多糖投喂[9]。試驗過程中監(jiān)控個體行為是否異?；蛩劳觥?/p>

1.4 各指標(biāo)的測定方法

1.4.1 血清性激素

10%H2O2處理后第2 d，取對照組、應(yīng)激處理組試驗龜共計16只，稱量質(zhì)量，-20 ℃冷凍麻痹60～80 min后，無應(yīng)激反應(yīng)，斷頸取血，取血6～8 mL于肝素鈉抗凝管中，靜置30 min后，以1500～2000 r/min離心15～20 min，冷藏待檢。使用放射免疫分析試劑盒(RIA法)，參考文獻[12]的方法，測定血清睪酮、卵泡刺激素、黃體生成素水平。試驗第30 d，基礎(chǔ)日糧投喂組、酵母多糖添加組個體同樣操作取血檢測性激素。

1.4.2 抗氧化物酶活性的測定

上述試驗龜斷頸取血時另取10 mL，4 ℃下 3500 r/min離心10 min，使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按說明測定血清中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛含量。

1.4.3 睪丸臟器系數(shù)

4組試驗龜在預(yù)設(shè)的時間取血結(jié)束，解剖摘取兩側(cè)睪丸，剔除附著的結(jié)締組織，用4 ℃預(yù)冷的0.65%生理鹽水沖洗后，濾紙吸干睪丸表面水分，稱量質(zhì)量。計算睪丸質(zhì)量占體質(zhì)量的百分比，即為睪丸臟器系數(shù)。

1.4.4 睪丸組織病理學(xué)觀察

睪丸臟器系數(shù)測試完畢，置睪丸于波恩氏液固定，24 h后換70%酒精保存。采用蘇木精—伊紅染色法制作石蠟組織切片，鏡檢(MOTIC BA310-T)、顯微攝影。每側(cè)睪丸采用Motic Images Advanced 3.2軟件隨機測量15個曲細精管管徑、生精上皮厚度、曲細精管管腔直徑，計算均值(以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用F檢驗或Levene檢驗各組方差齊性，進行單因素方差分析，如果方差分析結(jié)果顯示各組數(shù)據(jù)間存在顯著差異，應(yīng)進一步采用Duncan′s檢驗來進行比較，從而確定與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異的試驗組，以LSD法進行多重比較。上述數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excel 2010和SPSS 19.0進行統(tǒng)計，差異顯著臨界值α=0.05，差異極顯著臨界值為α=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對紅耳龜睪丸形態(tài)及臟器系數(shù)的影響

注射處理結(jié)束跟蹤觀察，對照組無明顯變化，其余3組試驗龜除在注射處有微紅腫現(xiàn)象外，其他方面與對照組無異樣，行動自如、反應(yīng)敏捷、攝食正常，2 d后注射處消腫恢復(fù)原樣，無個體死亡。解剖觀察睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)，試驗龜睪丸外觀圓潤光滑且飽滿，富有彈性，色澤為米白色，無充血現(xiàn)象，與對照組相比外部形態(tài)無明顯變化。同一個體兩側(cè)睪丸重量及大小相近，無明顯差異。

不同組間試驗龜睪丸系數(shù)差異顯著，應(yīng)激處理組睪丸明顯小于對照組(P<0.05)，說明H2O2對睪丸可能有一定的損傷；基礎(chǔ)日糧投喂組睪丸系數(shù)與應(yīng)激處理組相比差異不顯著(P>0.05)。酵母多糖添加組睪丸系數(shù)明顯大于其他3組，近乎其2倍，差異極顯著(P<0.01)，說明酵母多糖對睪丸氧化損傷具有一定的修復(fù)作用，可促進睪丸的生長發(fā)育。

表1 不同處理組雄性紅耳龜睪丸臟器系數(shù)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=8)

注:同行上標(biāo)相同字母表示平均值間差異不顯著(P>0.05)，相鄰字母表示平均值間差異顯著(P<0.05)，相間字母表示平均值間差異極顯著(P<0.01)，下同.

2.2 紅耳龜睪丸的組織病理學(xué)觀察

各組紅耳龜睪丸組織氧化損傷狀況及飼料中添加酵母多糖后的氧化損傷修復(fù)效應(yīng)見圖1，各組紅耳龜曲細精管管徑、生精上皮厚度、曲細精管管腔直徑見表2。對照組曲細精管管壁完整，由基底膜向管腔依次可見精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞充滿曲細精管，各級生精細胞排列有序、發(fā)育良好，管徑達(179.10±60.53) μm，生精上皮高度為(56.35±21.39) μm，管腔較小，管腔直徑為(74.32±31.97) μm(圖1a)；應(yīng)激處理組曲細精管生精上皮排列松散，次級精母細胞及精子細胞脫落進入管腔，生精上皮厚度減小為(47.84±12.48) μm，管腔增大為(103.08±40.62) μm，與對照組相比差異顯著(P<0.05)(圖1b)，說明氧化應(yīng)激損傷了睪丸?；A(chǔ)日糧投喂組睪丸曲細精管中各期生精細胞的形態(tài)沒有明顯的變化，生精上皮厚度減小為(39.92±13.39) μm，管腔直徑增大為(188.01±40.71) μm，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)(圖1c)，說明試驗個體睪丸氧化損傷自行修復(fù)能力有限。酵母多糖添加組睪丸曲細精管中初級精母細胞增多，各期生精細胞排列整齊，未見細胞損傷脫落，生精上皮厚度增大為(45.19±11.38) μm，管腔直徑減至(130.72±33.62) μm(圖1d)，差異顯著(P<0.05)。說明酵母多糖有助于睪丸生精上皮組織的修復(fù)再生，緩解氧化應(yīng)激損傷。

圖1 不同處理紅耳龜睪丸曲細精管組織結(jié)構(gòu)a：對照組；b：應(yīng)激處理組；c：基礎(chǔ)日糧投喂組；d：酵母多糖添加組.400×.

2.3 紅耳龜血液性激素含量的變化

3個試驗組紅耳龜血清中黃體生成素水平均略低于對照組，睪酮水平高于對照組，但均差異不顯著(P>0.05)；應(yīng)激處理組與對照組相比，3種性激素水平差異不顯著(P>0.05)，酵母多糖添加組與基礎(chǔ)日糧投喂組相比結(jié)果類似(表3)。說明氧化應(yīng)激損傷沒有干擾紅耳龜下丘腦—垂體—性腺作用軸。

表2 不同組紅耳龜睪丸曲細精管測量值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=8) μm

表3 不同處理組雄性紅耳龜血清性激素水平變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=8)

2.4 紅耳龜血清抗氧化物酶活性及丙二醛含量的變化

應(yīng)激處理組紅耳龜血清中過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性與對照組相比顯著降低(P<0.05)，丙二醛含量明顯升高2倍(P<0.01)；基礎(chǔ)日糧投喂組過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷光甘肽過氧化物酶活性略高于應(yīng)激處理組，差異不顯著(P>0.05)，但仍低于對照組，丙二醛含量繼續(xù)升高，幾乎是對照組的4倍(表4)。與基礎(chǔ)日糧投喂組相比，酵母多糖添加組3種抗氧化酶活性均明顯升高(P<0.05)，丙二醛含量顯著下降(P<0.05)。說明氧化應(yīng)激可抑制抗氧化酶活性，酵母多糖干預(yù)效應(yīng)明顯，可緩解氧化應(yīng)激。

表4 各組紅耳龜血清抗氧化酶活性及丙二醛含量變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=8) U/mL

3 討 論

3.1 氧化應(yīng)激對紅耳龜睪丸的氧化損傷

在試驗條件下制備龜鱉動物生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激模型是研究氧化應(yīng)激對龜鱉動物繁殖功能影響的基礎(chǔ)。目前許多氧化應(yīng)激模型是全身性的氧化應(yīng)激，對生殖器官的針對性不強，在不影響其正常生理功能的情況下，建立生殖腺的氧化應(yīng)激模型實屬不易。H2O2是常用的氧化劑，性質(zhì)穩(wěn)定，是研究氧化損傷的重要工具[13]。研究表明，進入體內(nèi)的H2O2極易透過細胞膜，與細胞內(nèi)鐵離子形成高活性的自由基，在體內(nèi)亞鐵離子環(huán)境存在下能通過Fenton反應(yīng)生成高活性的·OH(H2O2+Fe2++H+→·OH+Fe3++ H2O)，更強烈的損傷組織[14]。本試驗采用10%H2O2作為應(yīng)激源，按1.5 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射(睪丸附近)誘導(dǎo)紅耳龜睪丸氧化應(yīng)激，未見異常行為和死亡，睪丸臟器系數(shù)和睪丸病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，睪丸生精上皮各期生精細胞有不同程度的損傷，因為睪丸含有豐富的多不飽和脂肪酸(尤其是C20:4及C22:6)，以及潛在的活性氧生成系統(tǒng)，極易遭受氧化應(yīng)激的影響[15]。推斷注射腹腔內(nèi)過氧化氫可產(chǎn)生大量自由基引起氧化抗氧化失衡發(fā)生損傷，過量的活性氧導(dǎo)致生精細胞脂質(zhì)過氧化、蛋白變性失活、受損[16]。這說明這種生殖腺氧化應(yīng)激造模具有針對性，為研究氧化應(yīng)激對生殖系統(tǒng)的氧化損傷提供良好的模型。

3.2 氧化應(yīng)激對雄性紅耳龜血清性激素的影響

龜類性激素分泌調(diào)控與哺乳動物相似，睪丸是合成雄激素和精子發(fā)生的器官，通過下丘腦—垂體—性腺作用軸啟動控制間質(zhì)細胞合成雄激素，雄激素的分泌促進了精子的發(fā)生、成熟，促發(fā)求偶行為[17]。應(yīng)激對繁殖有負面影響[18]，在抓捕、囚禁應(yīng)激中均得到證實[19-20]。應(yīng)激可激活龜類下丘腦—垂體—腎上腺軸，腎上腺酮激素含量增加，抑制了睪丸功能，減少了雄激素分泌[20]。本試驗中，紅耳龜氧化應(yīng)激后血清性激素含量未出現(xiàn)明顯的變化，與上述研究結(jié)果不一致。同樣的結(jié)果在綠海龜(Cheloniamydas)的應(yīng)激研究中也發(fā)現(xiàn)，綠海龜如爭奪巢域、熱應(yīng)激以及雌海龜筑巢過程中遭遇緊張性應(yīng)激，腎上腺素、去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮含量均未發(fā)生顯著變化，性激素水平仍保持原有水平，繼續(xù)保持繁殖活力[21]。推測雄性紅耳龜可能與海龜一樣在長期進化過程中產(chǎn)生了適應(yīng)機制，以應(yīng)對繁殖需求。另外，性激素的分泌水平與龜類的繁殖周期密切相關(guān)，雄性紅耳龜求偶行為一般常發(fā)生在春季和秋季[22]。夏季下丘腦—垂體—性腺作用軸功能不活躍，應(yīng)激反應(yīng)敏感性下降，所以在夏季開展氧化應(yīng)激試驗血清性激素未發(fā)生明顯的改變，可能與此時的生理機能狀態(tài)有一定的關(guān)系。

3.3 氧化應(yīng)激對紅耳龜血清中抗氧化物酶活性的影響和酵母多糖干預(yù)效應(yīng)

機體處于不良環(huán)境或病理狀態(tài)下，會產(chǎn)生大量的自由基，使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)中，抗氧化系統(tǒng)對于抵抗氧化損傷、維持氧化還原平衡具有關(guān)鍵性作用，組織中抗氧化酶活性的高低間接反映機體清除氧自由基的能力[16]。應(yīng)激處理組產(chǎn)生氧化應(yīng)激，血清中過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低，說明腹注過氧化氫使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制抗氧化酶系統(tǒng)，使機體清除活性氧自由基、羥自由基能力有所下降，當(dāng)生物體內(nèi)累積過量的活性氧自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，丙二醛含量升高。

酵母多糖的免疫增強作用在水產(chǎn)養(yǎng)殖、家禽養(yǎng)殖中得到廣泛的應(yīng)用[23]，抗氧化作用也引起關(guān)注。孫正博[24]系統(tǒng)地研究了啤酒酵母多糖對小鼠抗氧化活性的影響，表明酵母多糖能顯著提高小鼠肝臟和血清中超氧化物歧化酶活性，并顯著降低丙二醛含量，清除過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物，抑制氧自由基自氧化。本試驗在紅耳龜氧化應(yīng)激后日糧中添加酵母多糖飼喂30 d，顯著提高血清中過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性，丙二醛含量下降顯著。與在凡納濱對蝦[10]飼料中添加酵母多糖可以顯著提高凡納對蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶、超氧陰離子含量試驗結(jié)果一致。說明酵母多糖作為抗氧化劑應(yīng)用于龜鱉養(yǎng)殖可以增加清除自由基的能力，是提高抗氧化作用的有效途徑。

綜上所述，過氧化氫可以使紅耳龜?shù)纳称鞴俨G丸產(chǎn)生氧化應(yīng)激，降低抗氧化酶活性和提高脂質(zhì)過氧化程度，造成睪丸的生精上皮氧化損傷，酵母多糖可作為飼料添加劑緩解氧化應(yīng)激損傷。