楊 行，章 翔，龍 昊，李 瑩，馮永勤，謝珍玉

( 1.海南大學(xué)，南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228; 2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228 )

隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境的持續(xù)惡化，養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病呈暴發(fā)性流行，已成為制約全球海水養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素，嚴(yán)重影響著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。其中弧菌病是海水動(dòng)物養(yǎng)殖中危害最為嚴(yán)重的病害之一[1-3]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)具有毒性大、耐藥性強(qiáng)、可侵染多種宿主的特點(diǎn)，已成為華南地區(qū)海水養(yǎng)殖最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一[4-5]。為防治疾病，多采用抗生素和化學(xué)藥品控制弧菌病，結(jié)果不僅使養(yǎng)殖水體的正常菌群遭到破壞，還導(dǎo)致病原菌株的耐藥性增強(qiáng)，嚴(yán)重污染近岸海域生態(tài)環(huán)境[6-7]。因此，建立哈維氏弧菌病原的生態(tài)防控技術(shù)是當(dāng)前確保我國(guó)華南地區(qū)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必由之路[8]。

利用微生物間的拮抗作用開展生物防治，是防控水產(chǎn)細(xì)菌性病原的重要有效途徑[9-10]。目前應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上的拮抗菌制劑主要有兩大類：(1)單一制劑，如熒光假單胞菌(Pseudomonnasfluorescens)、中間氣單胞菌(Aerommasmedia)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)、溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)、光合細(xì)菌、蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)等；(2)復(fù)合益生菌制劑，如美軍方、復(fù)合型活性生物凈水劑等，這類益生菌主要由硝化和反硝化假單胞菌、乳酸桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、反硝化細(xì)菌、枯草桿菌等菌株組成[11]。

近年來，自海南文昌地區(qū)中分離出的假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)WCPW15003對(duì)哈維氏弧菌的拮抗作用最為明顯[12]，但該菌在2216E培養(yǎng)基中的最高培養(yǎng)密度僅108cfu/mL，且針對(duì)不同密度弧菌病原的具體使用密度也未確定，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)和應(yīng)用。筆者將以2216E培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過額外補(bǔ)充一定含量的碳源和氮源，優(yōu)化假交替單胞菌WCPW15003的培養(yǎng)基組分；同時(shí)，確定不同密度弧菌病原所需要的最低拮抗菌密度，其結(jié)果將為今后開發(fā)防治熱帶海水養(yǎng)殖哈維氏弧菌病原的益生菌制劑及其施用技術(shù)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

假交替單胞菌WCPW15003，分離自海南文昌水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)底泥樣品(深80 cm)；哈維氏弧菌PBVH3311分離自海南臨高某對(duì)蝦養(yǎng)殖基地[13]。以上2株菌種保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取保藏于-80 ℃冰箱中的哈維氏弧菌PBVH3311和假交替單胞菌WCPW15003，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

取10 mL活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液或哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液，4000 r/min離心5 min，移除上清液，重懸于PBS溶液；進(jìn)行二倍倍比稀釋，稀釋5個(gè)密度梯度，分別測(cè)菌懸液吸光值。將各稀釋梯度吸光值與其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)進(jìn)行線性相關(guān)分析，要求r2>0.98。采用平板計(jì)數(shù)法[14]檢測(cè)相應(yīng)菌液中的活菌密度(cfu/mL)。根據(jù)菌懸液吸光值和活菌密度，繪制其活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定假交替單胞菌WCPW15003和哈維氏弧菌PBVH3311的生長(zhǎng)曲線。操作如下：加350 μL的2216E液體培養(yǎng)基至蜂窩板，分別接種活化的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液和哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液各50 μL，充分吸打混勻，于30 ℃下，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每小時(shí)檢測(cè)1次吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm。設(shè)置3個(gè)平行組。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

以2216E培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組分為：胰蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、磷酸鐵(0.01 g/L)，通過補(bǔ)加一定量的牛肉膏或(和)紅糖，組成假交替單胞菌培養(yǎng)基A、B、C(試驗(yàn)組)(表1)。每組設(shè)置3個(gè)平行。

表1 假交替單胞菌培養(yǎng)基

注：“+”表示添加，“-”表示不添加.

接種1%(體積比)活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液(密度為3×108cfu/mL)，振蕩培養(yǎng)(30 ℃，180 r/min)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)數(shù)法，確定各組菌懸液密度。采用SPSS 18.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

1.2.5 拮抗試驗(yàn)

將活化的哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液稀釋后加入2216E半固體培養(yǎng)基(pH 7.6、鹽度30)中，制作成病原菌平板。病原菌平板密度設(shè)置為101～108cfu/mL 共8個(gè)10倍倍比稀釋密度。采用瓊脂擴(kuò)散法[16]測(cè)定101～109cfu/mL 共9個(gè)10倍倍比稀釋的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液的拮抗作用效果，打孔直徑為5.98 mm。培養(yǎng)溫度為30 ℃，正置培養(yǎng)24 h，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(精確到mm)。設(shè)置3個(gè)平行組。采用Matlab軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合多元二次回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1 活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 假交替單胞菌WCPW15003活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值與其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的線性方程為：y=1.8976x+0.137，r2=0.9877[x為假交替單胞菌WCPW15003稀釋倍數(shù)倒數(shù)的值，y為假交替單胞菌WCPW15003稀釋后吸光值(OD600)]；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=134.36x-17.976，r2=0.9924[x為假交替單胞菌WCPW15003吸光值(OD600)，y為假交替單胞菌WCPW15003活菌菌落數(shù)]，菌液吸光值與活菌數(shù)之間有顯著線性關(guān)系(圖1)。因此，假交替單胞菌WCPW15003的菌懸液吸光值與其活菌數(shù)量間存在良好線性關(guān)系，可用于后續(xù)菌液密度的測(cè)定。

圖1 假交替單胞菌WCPW15003活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 哈維氏弧菌 PBVH3311活菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值與其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的線性方程為：y=1.42x+0.2052，r2=0.981[x為哈維氏弧菌PBVH3311 稀釋倍數(shù)倒數(shù)的值，y為哈維氏弧菌PBVH3311稀釋后吸光值(OD600)]；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5.1028x-1.2664，r2=0.9956[x為哈維氏弧菌PBVH3311吸光值(OD600)，y為哈維氏弧菌PBVH3311活菌菌落數(shù)]，菌液吸光值與活菌數(shù)之間有顯著線性關(guān)系(圖2)。因此，哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液吸光值與其活菌數(shù)量間線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)菌液密度的測(cè)定。

圖2 哈維氏弧菌 PBVH3311活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線

2.2.1 假交替單胞菌 WCPW15003生長(zhǎng)曲線

假交替單胞菌WCPW15003的生長(zhǎng)曲線符合典型“S”型細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。即假交替單胞菌WCPW15003的生長(zhǎng)周期可分為停滯期、增長(zhǎng)期、平臺(tái)期和衰亡期共4個(gè)時(shí)期。其中，接種后0～0.5 h為該菌株的停滯期，0.5～1.5 h為緩慢增長(zhǎng)期，1.5～2.5 h進(jìn)入短暫平臺(tái)期，2.5～10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，10～36 h進(jìn)入平臺(tái)期，36 h后進(jìn)入衰亡期(圖3)。

圖3 假交替單胞菌WCPW15003生長(zhǎng)曲線

2.2.2 哈維氏弧菌PBVH3311菌株生長(zhǎng)曲線

哈維氏弧菌PBVH3311的生長(zhǎng)曲線符合典型“S”型細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。即哈維氏弧菌PBVH3311的生長(zhǎng)生長(zhǎng)周期可分為停滯期、增長(zhǎng)期、平臺(tái)期和衰亡期共4個(gè)時(shí)期。接種后0～0.5 h進(jìn)入停滯期，0.5～1.5 h進(jìn)入增長(zhǎng)期，1.5～4.5 h進(jìn)入短暫平臺(tái)期，4.5～20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，20～44 h進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，44～68 h進(jìn)入平臺(tái)期，68 h后進(jìn)入衰亡期(圖4)。

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)24 h后，不同假交替單胞菌WCPW15003培養(yǎng)基中菌懸液的密度為2.31×108～3.36×109cfu/mL(圖5)。其中2216E培養(yǎng)基的活菌數(shù)最低，為2.31×108cfu/mL；試驗(yàn)組A的活菌數(shù)最高，為3.36×109cfu/mL；試驗(yàn)組B的活菌數(shù)為1.33×109cfu/

圖4 哈維氏弧菌PBVH3311生長(zhǎng)曲線

mL；試驗(yàn)組C的活菌數(shù)為1.95×109cfu/mL。與對(duì)照組相比，3個(gè)試驗(yàn)組的菌懸液密度均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；盡管試驗(yàn)組B和試驗(yàn)組C間僅達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，但試驗(yàn)組A與試驗(yàn)組B或試驗(yàn)組C間均達(dá)到了極顯著差異(P<0.01)。

圖5 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.4 拮抗試驗(yàn)

當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為101～102cfu/mL時(shí)，所有組別未出現(xiàn)明顯的拮抗效果。當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為103cfu/mL，抑菌圈直徑為(8.40±0.16) mm；當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為104、105cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為105cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(9.64±0.07)、(8.24±0.22) mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈(圖6)。

當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為107cfu/mL，抑菌圈直徑為(18.15±0.09) mm；當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為107、108cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為108cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(18.53±1.34)、(11.68±2.58) mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈，外側(cè)還有一圈半透明抑菌圈(圖6)。

總之，只有當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311≥103cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003才會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，且假交替單胞菌WCPW15003的密度應(yīng)相當(dāng)于或高于哈維氏弧菌PBVH3311的密度，拮抗作用大小與假交替單胞菌WCPW15003密度呈正相關(guān)性。

表3 不同密度假交替單胞菌與哈維氏弧菌拮抗抑菌圈直徑(打孔器直徑5.98 mm) mm

注：表中數(shù)據(jù)為剔除掉打孔器外徑5.98 mm的結(jié)果，“0”表示不產(chǎn)生拮抗效果.

圖6 假交替單胞菌WCPW15003與哈維氏弧菌PBVH3311拮抗作用效果a.假交替單胞菌；b.哈維氏弧菌；c.全透明抑菌圈；d.半透明抑菌圈.

2.5 數(shù)據(jù)分析

(1)當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時(shí)(低密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結(jié)果為: f(x，y)=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×103cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×103cfu/mL)]。

當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時(shí)，若要實(shí)現(xiàn)100%拮抗效果，即r2=1(方程實(shí)際r2=0.9866)，此時(shí)f(x，y)=5.98×(1+0.0134)=6.06。因此，當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311為103～105cfu/mL時(shí)，實(shí)現(xiàn)100%拮抗作用的方程應(yīng)為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2。

(2)當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107、108cfu/mL時(shí)(高密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結(jié)果為：f(x，y)=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×106cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×106cfu/mL)]。

當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107和108cfu/mL時(shí)，若要實(shí)現(xiàn)100%拮抗效果，即r2=1(方程實(shí)際r2= 0.9544)，此時(shí)f(x，y)=5.98×(1+0.0456)=6.25。因此，當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311為106～108cfu/mL時(shí)，實(shí)現(xiàn)100%拮抗作用的方程應(yīng)為：6.25= 8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。

3 討 論

3.1 拮抗菌WCPW15003及其培養(yǎng)基優(yōu)化

哈維氏弧菌是南海近岸海洋環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種之一[17]，也是華南地區(qū)海水養(yǎng)殖動(dòng)物最常見的細(xì)菌性病原[4]，常引發(fā)對(duì)蝦發(fā)光病、對(duì)蝦早期偷死綜合征、石斑魚爛身病等多種嚴(yán)重疾病[18-19]。

革蘭氏陽(yáng)性菌被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，其中應(yīng)用較為普遍的主要是乳酸菌和一些芽孢桿菌等。Zokaeifar等[20]報(bào)道，將兩株芽孢桿菌以108cfu/mL密度添加到飼料中，投喂8周齡凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)時(shí)，能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)及提高消化酶活力，且對(duì)哈維氏弧菌有明顯抑菌活性。雖然革蘭氏陰性菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用相對(duì)較少，但有些假交替單胞菌屬菌種等也是公認(rèn)的益生菌。Fjellheim等[21]報(bào)道，假交替單胞菌對(duì)大西洋鱈(Gadusmorhua)生長(zhǎng)環(huán)境中的鰻弧菌(V.anguillarum)具有拮抗作用；Kesarcodi-Watson等[22]報(bào)道了假交替單胞菌可保護(hù)貝類幼苗免受燦爛弧菌(V.splendidus)的侵染；其他的研究結(jié)果也表明，假交替單胞菌對(duì)哈維氏弧菌、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)等多種病原體有顯著拮抗作用[23-27]。這與本研究結(jié)果基本一致，即假交替單胞菌WCPW15003對(duì)哈維氏弧菌PBVH3311具有明顯的拮抗作用。

在大多數(shù)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，只有當(dāng)弧菌密度超過104cfu/mL時(shí)，才易暴發(fā)養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病；同時(shí)，通過回歸方程可得知，假交替單胞菌WCPW15003密度應(yīng)大于或等于養(yǎng)殖水體中弧菌密度，才會(huì)表現(xiàn)出明顯的拮抗效果。因此，提高菌液中菌體密度是實(shí)現(xiàn)假交替單胞菌WCPW15003應(yīng)用的必要前提。盡管2216E是絕大多數(shù)海洋細(xì)菌的培養(yǎng)基[28]，但由于營(yíng)養(yǎng)成分含量相對(duì)單一，不適宜假交替單胞菌WCPW15003的高密度培養(yǎng)。筆者通過對(duì)2216E培養(yǎng)基的優(yōu)化，可使假交替單胞菌WCPW15003密度由2.31×108cfu/mL升至3.36×109cfu/mL，可基本滿足假交替單胞菌WCPW15003規(guī)?；囵B(yǎng)和在小水體應(yīng)用的要求，為今后建立該拮抗菌的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

3.2 拮抗菌WCPW15003對(duì)哈維氏弧菌病原拮抗機(jī)制

在基于培養(yǎng)皿的拮抗試驗(yàn)中，當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度為103～105cfu/mL時(shí)，抑菌圈為清晰的全透明圈；當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度大于106cfu/mL時(shí)，抑菌圈為兩個(gè)同心圓，全透明圈在內(nèi)，半透明圈在外。據(jù)此推測(cè)，當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較低時(shí)，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003通過識(shí)別弧菌并分泌胞外產(chǎn)物啟動(dòng)了第一套具有殺菌作用的拮抗機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了低密度的拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003的拮抗作用，擬合方程為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2；當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較高時(shí)，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003除啟動(dòng)上述第一套拮抗機(jī)制外，還同時(shí)啟動(dòng)了具有抑菌作用的第二套拮抗機(jī)制，且該機(jī)制分泌的胞外產(chǎn)物在瓊脂中的擴(kuò)散速度大于第一套拮抗機(jī)制分泌的胞外產(chǎn)物，因此，產(chǎn)生半透明抑菌圈大于全透明圈的現(xiàn)象，此時(shí)的擬合方程為：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。這一結(jié)果為后續(xù)開展該拮抗菌作用機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)。同時(shí)表明，該拮抗菌既可殺滅貧營(yíng)養(yǎng)海水中的少量弧菌，又可抑制富營(yíng)養(yǎng)海水中出現(xiàn)高密度的弧菌，還可保持富營(yíng)養(yǎng)水體中剩余少量弧菌(承擔(dān)養(yǎng)殖水體的物質(zhì)循環(huán)作用)，從而有利于成功構(gòu)建基于細(xì)菌的“活水”的養(yǎng)殖系統(tǒng)。也就是說，該拮抗菌今后不僅可用于養(yǎng)殖前期的海水消毒，還可用于養(yǎng)殖水體中弧菌密度控制，防止因高密度弧菌引發(fā)海水養(yǎng)殖弧菌病的暴發(fā)，且不會(huì)導(dǎo)致水體因完全缺少細(xì)菌而成為“死水”。

總之，本研究不僅確定了假交替單胞菌WCP15003的生長(zhǎng)特性及其對(duì)哈維氏弧菌PBVH3311存在顯著的拮抗效果，還根據(jù)不同弧菌密度率先確定了該拮抗菌對(duì)弧菌的多元二次回歸方程，可根據(jù)養(yǎng)殖水體中弧菌密度，確定拮抗菌的準(zhǔn)確使用量，這為假交替單胞菌WCPW15003在生產(chǎn)中精準(zhǔn)施用技術(shù)開發(fā)夯實(shí)了理論基礎(chǔ)。