甄曉然，沈 輝，萬夕和,蔣 葛，范賢平，喬 毅，史文軍，朱志楊，沙士兵，徐錦忠

( 1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007 )

近年來，隨著對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，對蝦疾病的發(fā)生也日益增多，嚴(yán)重制約了對蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)急性肝胰腺壞死綜合征是近年來我國發(fā)生較為嚴(yán)重的一種蝦類疾病，該病主要是由副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)感染所引起，患病對蝦出現(xiàn)空腸空胃、肝胰腺萎縮等癥狀，發(fā)病率和死亡率較高[3-5]。

生物拮抗是微生物群落內(nèi)普遍存在的自然現(xiàn)象，利用動物病原菌的拮抗細(xì)菌制成有益微生物制劑，拮抗菌與病原菌相互抵制、相互排斥、相互制約[6]，對養(yǎng)殖水體中的病原微生物產(chǎn)生拮抗作用，抑制病原菌的生長，改善養(yǎng)殖環(huán)境，調(diào)節(jié)對蝦體內(nèi)的微生態(tài)平衡，具有生物安全和環(huán)境友好等優(yōu)點，在對蝦疾病生物防治領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越多[7]。

筆者自江蘇南部沿海灘涂沉積物中分離到一株對多株凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合征病原弧菌具有明顯拮抗效果的細(xì)菌，進行菌株的安全性試驗，并對其分類學(xué)地位及擴培工藝進行研究，以期為凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合征的防控提供技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

14株病原菌分離自江蘇如東患急性肝胰腺壞死綜合征的凡納濱對蝦肝胰腺，鑒定為副溶血弧菌，經(jīng)人工攻毒試驗證實其具較強的感染力。

1.2 拮抗菌分離與篩選

1.2.1 分離

自江蘇南部沿海灘涂沉積物采集泥樣少許，分別用滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，涂布于LB培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、高氏一號平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，分離菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 初篩

取上述副溶血弧菌接種于2216E肉湯培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)配成1.5×107cfu/mL的菌懸液，滴入無菌2216 E平板，使平板表面展布少許菌懸液。挑取復(fù)蘇24 h的待測菌點種于平板。每平板設(shè)3個平行，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察點種區(qū)附近抑菌透明圈或覆蓋圈的大小。

1.2.3 復(fù)篩

重復(fù)上述涂布步驟，將初篩效果較好的菌株采用濾紙片法測定拮抗效果，用滅菌鑷子等距離放置4片無菌濾紙片于涂布好弧菌的平板，無菌生理鹽水將拮抗菌發(fā)酵液調(diào)至3.0×108cfu/mL，向其中3片加入5 μL，另1片加入5 μL生理鹽水作為空白對照，每個平板3 個平行。在28 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察有無覆蓋現(xiàn)象和抑菌圈的出現(xiàn)，用游標(biāo)卡尺測量覆蓋圈或抑菌圈的直徑。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株的形態(tài)觀察及生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[8-9]對菌株進行生理生化鑒定。結(jié)合分離菌在不同平板上的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和形態(tài)特點，進行細(xì)菌的初步鑒定。

1.3.2 16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用天根生物專用試劑盒提取純化細(xì)菌DNA，16S rDNA序列擴增采用細(xì)菌通用引物27 F: 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492 R: 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。應(yīng)用BLAST軟件將所得序列與GenBank中的有關(guān)序列進行同源性分析，選取同源性高的序列，利用Mega 5.0進行多重比較后通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株安全性試驗

試驗用凡納濱對蝦幼蝦[平均體長(4.0±0.5) cm]取自如東某養(yǎng)殖場，幼蝦在暫養(yǎng)7 d后隨機分組。試驗處理分浸浴組和投喂組。浸浴組：將待測菌株發(fā)酵后用生理鹽水稀釋密度為1×109、1×108、1×107cfu/mL，以0 cfu/mL為空白對照組，所有密度均設(shè)3個平行組，每組試驗對蝦30尾；投喂組：所篩選菌株與幼蝦飼料混合，密度調(diào)至1×1010、1×109、1×108cfu/g，每個密度梯度設(shè)置3個平行組，同時設(shè)置空白組，空白對照組投喂生理鹽水混合的飼料，各組試驗對蝦30尾。

試驗進行 10 d，期間水溫(20±1) ℃，鹽度12.0，每日按照對蝦質(zhì)量的1%投喂飼料。保持充氣，每日吸污，采用平均法記錄10 d試驗中幼蝦的發(fā)病癥狀和死亡等狀況。

1.5 菌株生長特性

研究3種培養(yǎng)條件(pH、溫度、鹽度)對拮抗菌H0011生長的影響，并繪制其生長曲線。

1.5.1 pH

將液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9，共7組。按1%接種量將拮抗菌H0011接種于LB液體培養(yǎng)基中，每個pH設(shè)置3個平行，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取菌懸液梯度稀釋，涂布計數(shù)。

1.5.2 溫度

將拮抗菌H0011接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別于10、20、25、30、35、40、45 ℃，180 r/min培養(yǎng) 24 h，每個溫度設(shè)置3個平行，取菌懸液梯度稀釋，涂布計數(shù)。

1.5.3 鹽度

配制0、10、20、30、40、50不同鹽度梯度的LB液體培養(yǎng)基，分別接種拮抗菌H0011，每個鹽度梯度設(shè)3個平行，180 r/min培養(yǎng)24 h后，分別取菌懸液梯度稀釋，涂布計數(shù)。

1.5.4 菌株生長曲線

按1%接種量將拮抗菌H0011接種于LB液體培養(yǎng)基，180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，梯度稀釋涂布計數(shù)，繪制時間與活菌數(shù)量的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離篩選

在江蘇沿海灘涂分離獲得252株菌，用點種法初步篩選到6株對病原菌具有拮抗作用的菌株，分別為H0011、H0013、H0017、H0027、H0030、H0037。采用濾紙片法進行復(fù)篩，獲得1株對14株對蝦急性肝胰腺壞死綜合征病原副溶血弧菌均有拮抗作用的菌株(H0011)。采用菌株H0011發(fā)酵液對14株攜帶毒力基因的副溶血弧菌進行抑菌效果分析，抗菌譜結(jié)果見表1。

表1 菌株H0011對14株致病性副溶血弧菌的抗菌效果

注：(1)“+++”代表極敏感，“++”代表高敏，“+”代表中敏.(2)抑菌圈(覆蓋圈)直徑> 20 mm為極敏感“+++”；15 mm<直徑<20 mm為高敏“++”；10 mm<直徑<15 mm為中敏“+”；直徑<10 mm為低敏或無效“—”.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

菌株H0011在LB平板上24 h生長為直徑1～3 mm的圓形、扁平菌落；菌落呈米粉色、邊緣不整齊，濕潤凸起、表面凹凸不平；短桿狀，革蘭氏陰性。

2.2.2 生理生化結(jié)果

菌株H0011生理生化試驗見表2，根據(jù)以上結(jié)果，按細(xì)菌雙歧索引鑒定步驟，該菌鑒定為居幼蟲普羅威登斯菌(Providenciavermicola)，鑒定結(jié)果的可信度達(dá)81.5%。

表2 生化鑒定試驗結(jié)果

注：“+”代表“陽性”，“-”代表“陰性”.

2.2.3 16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物對菌株H0011的DNA進行PCR擴增，獲得1443 bp序列。將該序列提交到GenBank，獲得登錄號為MH 922927，使用BLAST在線數(shù)據(jù)進行序列比對分析，結(jié)果顯示菌株H0011與普羅威登斯菌KY 818989.1的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%。選取普羅威登斯菌屬及其他屬與之同源性相近的11株細(xì)菌的16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。進化樹的結(jié)果初步表明，分離獲得的菌株H0011為普羅威登斯菌屬，但未能鑒定到種。

圖1 基于16S rDNA序列的菌株H0011系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 安全性試驗

通過高密度脅迫試驗測試篩選普羅威登斯菌H0011的結(jié)果見表3。1×108、1×1010cfu/mL浸浴組的凡納濱對蝦，在整個試驗過程中健康，攝食正常，活力良好，無空腸和死亡現(xiàn)象；1×109cfu/mL浸浴組的3組平行中有一組對蝦出現(xiàn) 1 尾空腸現(xiàn)象。投喂組對蝦在整個試驗過程中健康，攝食正常，活力良好，無空腸和死亡現(xiàn)象。試驗期間，浸浴組空白對照組對蝦無死亡，但其中有一組出現(xiàn)1尾空腸現(xiàn)象。108cfu/mL密度以下的各組別之間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 菌株的生長特性

2.4.1 溫度對拮抗菌生長的影響

普羅威登斯菌H0011生長情況見圖2，在10～45 ℃溫度內(nèi)均能生長。當(dāng)溫度為10～20 ℃時，生長速度較慢，生長差異較??；而當(dāng)溫度在20 ℃以后表現(xiàn)出了明顯的生長優(yōu)勢，且30 ℃時生長速度最快。

表3 普羅威登斯菌H0011脅迫下的凡納濱對蝦試驗結(jié)果

圖2 不同溫度下普羅威登斯菌H0011的生長情況

2.4.2 鹽度對拮抗菌生長的影響

普羅威登斯菌H0011在不同鹽度下的生長情況見圖3。在鹽度0～60內(nèi)均能生長，其中最適生長鹽度為10。在鹽度0～10內(nèi)，隨著鹽度的升高，普羅威登斯菌 H0011 菌落數(shù)逐漸增多，在鹽度10的時候達(dá)到最大值；當(dāng)鹽度>10時，普羅威登斯菌 H0011的菌落數(shù)逐漸降低，但生長情況差異不顯著。

圖3 不同鹽度下普羅威登斯菌H0011的生長情況

2.4.3 pH對拮抗菌生長的影響

普羅威登斯菌H0011在不同pH下的生長情況見圖 4。在pH 4～10內(nèi)均能生長，其中最適pH=8。在pH 4～8時，其生長速度呈上升趨勢，在pH=8時菌落數(shù)達(dá)到最大值；當(dāng)pH>8時，普羅威登斯菌H0011菌落數(shù)逐漸降低。

圖4 不同pH下普羅威登斯菌H0011的生長情況

2.4.4 普羅威登斯菌H0011的生長曲線

普羅威登斯菌 H0011的生長曲線見圖5。0～4 h 為遲緩期，4～20 h為生長對數(shù)期，菌體快速生長，20 h時菌體數(shù)量達(dá)最高值，此時菌體代謝活性高且生活力強。此后進入生長穩(wěn)定期，直到76 h后由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)缺乏及有害代謝產(chǎn)物積累，菌體代謝活性逐漸降低，發(fā)生衰老并自溶，菌體生長進入衰亡期。細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)后密度可達(dá)到2.48×1010cfu/mL，且能長時間保持穩(wěn)定，表明該拮抗菌普羅威登斯菌 H0011 具有良好的生長和活性保持能力。

圖5 普羅威登斯菌 H0011的生長曲線

3 討 論

3.1 拮抗菌在水產(chǎn)界的應(yīng)用

生物間的拮抗關(guān)系普遍存在于自然界中，許多海洋細(xì)菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原微生物可產(chǎn)生拮抗作用。以拮抗菌為主的微生物制劑可以減少抗生素的使用，抑制病原菌的生長，達(dá)到良好的生物防控效果[10]。海洋細(xì)菌作為益生菌的研究是當(dāng)前一個熱點，1966年，Burkholder等[11]發(fā)現(xiàn)了第一株有抑菌活性的海洋細(xì)菌，隨后越來越多的病原菌拮抗細(xì)菌被篩選出。Tanasomwang等[12]自斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)幼體分離篩選出可產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)的海洋細(xì)菌，對魚類、貝類的致病弧菌有良好的抑制作用。這些菌株作為益生菌被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的防治中，均獲得良好的抑制效果。

應(yīng)用于水產(chǎn)疾病控制且常見的拮抗菌有乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和假單胞菌(Pseudomonas)等[13-16]，然而針對特定病原的拮抗菌研究相對較少，因此加強病原拮抗菌理論研究和應(yīng)用開發(fā)有助于服務(wù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[17]。本研究從江蘇南部灘涂泥樣中篩選到一株對對蝦急性肝胰壞死綜合征弧菌有良好拮抗效果的菌株H0011，經(jīng)16S rDNA鑒定為普羅威登斯菌，而生理生化鑒定為居幼蟲普羅威登斯菌，但結(jié)果可信度為81.5%。由于16S rDNA鑒定可信度可達(dá)99%，因此本研究最后將該菌定為普羅威登斯菌，僅鑒定到屬。普羅威登斯菌是腸桿菌科中常見的革蘭氏陰性菌，常被用來作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的有益細(xì)菌。

3.2 普羅威登斯菌的應(yīng)用

對于普羅威登斯菌開發(fā)利用的有關(guān)研究報道較多。普羅威登斯菌可以用來作為植物害蟲的抑制劑，周峰等[18]利用雷氏普羅威登斯菌(P.rettgeri)與營養(yǎng)物質(zhì)尿素混合后制成 UN06顆粒劑，對番茄根結(jié)線蟲(Meloidogyne)、黃瓜根結(jié)線蟲、煙草根結(jié)線蟲的防效達(dá)到90.17%、88.66%和85.98%。Surany[19]發(fā)現(xiàn)，在昆蟲的幼蟲到達(dá)蛹前階段時，普羅威登斯菌可產(chǎn)生與昆蟲自身的神經(jīng)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互作用的物質(zhì)，抑制或干擾甲殼素的合成，使昆蟲無法完成生命周期并在未成熟階段死亡。普羅威登斯菌在環(huán)境保護上的應(yīng)用也有報道。雷氏普羅威登斯菌可用于含氮有機廢水的處理，有效去除水體中的有機氮、氨氮、亞硝氮及硝氮，并同時實現(xiàn)對有機碳的去除[20]。Mukherjee等[21]自受污染的地下水中分離出一種居幼蟲普羅威登斯菌氏菌(KX926492)，對氟的最大去除率達(dá)82%。吳小毛等[22]發(fā)明了一種利用斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii)修復(fù)核凈污染的土壤和水體的方法，可解決農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中部分農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題及環(huán)境污染問題。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控領(lǐng)域，陳償?shù)萚23]用普羅威登斯菌22號制備了一種防控溶藻弧菌(V.alginolyticus)或副溶血弧菌微生物制劑，用于改善養(yǎng)殖水質(zhì)，清除養(yǎng)殖系統(tǒng)中的溶藻弧菌或副溶血弧菌，預(yù)防養(yǎng)殖疾病的發(fā)生。曲凌云等[24]發(fā)現(xiàn)了一株雷氏普羅威登斯菌，其在與海水魚類盾纖毛蟲病原共同培養(yǎng)時，能在24 h內(nèi)殺滅共培養(yǎng)體系中的盾纖毛蟲，為防治海水魚類盾纖毛蟲病的防控提供了新方法。

普羅威登斯菌同時又是一種人類或者動物致病菌，可導(dǎo)致人類下呼吸道或尿路感染[25-27]。有研究發(fā)現(xiàn)，雷氏普羅威登斯菌可導(dǎo)致?lián)P子鱷(Alligatorsinensis)發(fā)病及大量死亡[28]，中越邊境猝死水牛體內(nèi)也曾分離獲得過拉氏普羅威登斯菌(P.rustigianii)[29]。說明普羅威登斯菌雖在一些方面對人類、動物界、環(huán)境等是有益菌，但同時也存在安全隱患。本研究結(jié)果表明，所分離獲得的高效拮抗作用普羅威登斯菌H0011在108cfu/mL浸浴組和108cfu/mL投喂組試驗處理過程中，組內(nèi)對蝦健康，活力良好，未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象，該菌株在常規(guī)用量內(nèi)對對蝦是安全的。

3.3 本試驗拮抗菌的優(yōu)化及應(yīng)用

一般認(rèn)為，細(xì)菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的含量與其生長條件密切相關(guān)，如pH、培養(yǎng)溫度等[30]，菌體的最適溫度亦是其產(chǎn)生拮抗效果的最適溫度，且pH與拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生也有很大關(guān)系，不同抗菌物質(zhì)在不同pH中產(chǎn)生，其pH活性范圍不同[31]。本研究優(yōu)化了普羅威登斯菌H0011的生長條件，其最適溫度為30 ℃，最適初始pH為8，最適生長鹽度為10，說明其發(fā)酵條件溫和，適合擴大培養(yǎng)，且適合對其做進一步深入的研究，這將為對蝦急性肝胰腺壞死綜合征的防控提供新的思路。

目前，我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中急性肝胰腺壞死綜合征病情十分嚴(yán)峻，利用拮抗機理進行以菌抗菌防治有顯著效果，未來應(yīng)用前景可觀。本試驗針對凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合征所獲得的益生菌普羅威登斯菌H0011，可以作為拮抗作用菌在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中進行應(yīng)用，在當(dāng)前凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合征的防控應(yīng)具有較好的應(yīng)用價值。