楊玉瑩,張一敏,毛衍偉,梁榮蓉,董鵬程,楊嘯吟,朱立賢,*,羅 欣,2,*,張文華,曹 暉
(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018;2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095;3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)試驗站,寧夏 中衛(wèi) 755000;4.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系寶雞試驗站,陜西 寶雞 721000)
我國牦牛資源豐富,主要分布于青海、甘肅、西藏、四川、新疆和云南省,占世界牦牛總量的95%[1]。牦牛肉富含蛋白質(zhì),脂肪含量低,含有人體所需的多種脂肪酸,能夠滿足人們對高品質(zhì)牛肉的需求[2-3]。牛肉富含多種氨基酸和礦物質(zhì)元素,具有消化吸收率高等特點,深受人們喜愛[4]。近幾年,隨著居民消費水平的提高,對牛肉的消費量也越來越大,人們更加重視牛肉和牛肉制品的品質(zhì)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),肌纖維的形態(tài)特征(如肌纖維總數(shù)和肌纖維橫截面積)與肌纖維的收縮及代謝特性是影響肉品質(zhì)的主要因素[7-8]。
骨骼肌主要由不同類型的肌纖維組成,不同類型的肌纖維具有不同形態(tài)特征和收縮及代謝特性。根據(jù)氧化代謝酶[9]和肌球蛋白三磷酸腺苷酶(myosn adenosine triphosphatase,mATPase)的染色情況[10]分類,可以將肌纖維類型分為I型(慢速氧化型)、IIA型(快速氧化型)和IIB型(快速酵解型)。Lefaucheur等[11]利用免疫組化的方法將豬骨骼肌纖維類劃分為I、IIA、IIB和IIX型,分別對應(yīng)于慢速氧化型(I)、快速氧化型(IIA)、快速酵解型(IIB)和中間型肌纖維(IIX),其收縮速率為I<IIA<IIX<IIB[12-13]。
影響骨骼肌中肌纖維類型組成、直徑、面積比和數(shù)目比的因素很多,如性別、年齡、品種、激素和身體活動等,其中部位是一個重要因素。關(guān)于肌纖維特性和肉品質(zhì)特性之間關(guān)系的研究在豬肉中較多,在反芻動物(如牛、羊)中的研究較少[14]。郎玉苗等[15]研究了中國西門塔爾牛背最長肌、腰大肌和半腱肌肌纖維特性和肉品質(zhì)特性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)不同部位肌肉肌纖維特性可以影響牛肉品質(zhì)。關(guān)于韓牛不同部位肌肉肌纖維特性和肉品質(zhì)間的關(guān)系也有報道[16]。解祥學(xué)等[17]研究對比了利木贊牛、皮埃蒙特牛、中國西門塔爾牛、魯西牛、秦川牛和晉南牛的肌纖維特性,發(fā)現(xiàn)不同牛種間也存在顯著差異。王莉[18]研究了牦牛不同部位肌纖維特性對牛肉嫩度的影響,發(fā)現(xiàn)I型肌纖維比例越高,宰后嫩度改善效果越好,但鮮見牦牛肉背最長肌、腰大肌和半膜肌這3 個部位肌肉肌纖維特性和肉品質(zhì)之間關(guān)系的相關(guān)報道。
因此本研究選取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌為研究對象,采用酶組織化學(xué)染色法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法測定牦牛的肌纖維特性,包括肌纖維類型、直徑、面積比和數(shù)目比,并測定了這3 個部位肌肉的剪切力、肌節(jié)長度、肉色、蒸煮損失率和pH值,以期從肌纖維角度解釋不同部位肌肉的品質(zhì)差異。
選取青海省海北州海晏縣牦牛2~3 歲健康放牧公牛10 頭,胴體質(zhì)量(98.15±8.45)kg。
包埋劑 日本Sakura公司;Tris-base 美國Sigma公司;ATP鈉鹽 北京Solarbio公司;硝酸鈷、硫化銨、二甲苯、蔗糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix ExTaq?(Tli RNaseH Plus)、RNAiso、RNase-free水 寶生物工程(大連)有限公司。
CRYOSTAR NX50型冰凍切片機 美國Thermo公司;819型切片刀 德國徠卡儀器有限公司;Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng) 日本尼康公司;TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;SP62型便攜式色度儀 美國愛色麗公司;實時熒光定量PCR儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;核酸測定儀德國Implen公司。
1.3.1 樣品處理
牦牛宰后45 min分別取背最長肌、腰大肌和半膜肌1 cm×1 cm×2 cm樣品后用錫紙包裝后放置于液氮中保存,用于mATPase染色。取1 g肉柱于凍存管中,放入液氮中,然后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存,用于提取RNA。在宰后48 h進行分割,取背最長肌、腰大肌和半膜肌放入泡沫箱(加冰袋)運回實驗室(到達實驗室為成熟第3天),用于品質(zhì)指標的測定。
1.3.2 pH值的測定
用SenvonGo便攜式pH計分別測定背最長肌、腰大肌和半膜肌的pH值,將pH計探頭插入3 cm左右,當pH值穩(wěn)定后讀取數(shù)值,3 次重復(fù)取平均值[19]。
1.3.3 肉色的測定
取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌上成熟3 d的肉樣,在空氣中發(fā)色30 min,用便攜式色度儀測定L*、a*、b*值,測定6~8 個位點取平均值[19]。
1.3.4 剪切力的測定
參考Hou Xu等[20]的測定方法,分別從成熟3 d的背最長肌、腰大肌和半膜肌上取厚度約為2.5 cm的牛排樣品,真空包裝后80 ℃水浴加熱至肉塊中心溫度70 ℃,之后0~4 ℃冷卻過夜。用空心取樣器(直徑為1.27 cm)沿肌纖維方向取肉柱,注意避開筋腱和結(jié)締組織,用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀的HDP/BSW探頭測定肉柱的剪切力。
1.3.5 肌節(jié)長度的測定
參考Cross[21]與Li Ke[22]等的方法,并稍作修改。選取2 g牦牛肉樣品,加入18 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液(提前放于4 ℃預(yù)冷),低速勻漿(轉(zhuǎn)速約為6 000 r/min)1 min,用懸浮液制作載玻片,在光學(xué)顯微鏡下放大1 000 倍觀察并拍照。每個樣品取5 個平行,選取30 張照片,用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測量肌節(jié)長度,測量結(jié)果的平均值即為該樣品的肌節(jié)長度。
1.3.6 蒸煮損失率的測定
分別取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌的肉樣稱其質(zhì)量(m1),包裝后將溫度計插入肉的中心部位,80 ℃水浴加熱肉塊至中心溫度70 ℃,在室溫冷卻20 min后放于0~4 ℃過夜,取出肉塊,表面汁液用濾紙吸干,稱質(zhì)量(m2)[19]。蒸煮損失率按下式計算。
1.3.7 組織化學(xué)分析測定肌纖維指標
參考Brooke等[10]的方法,并稍加修改。將牦牛肉用冷凍切片機切成10 μm的新鮮切片,進行堿孵育mATPase染色。5 g Tris-base加入0.449 g CaCl2,加入蒸餾水,定容至250 mL,用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至10.4。再配制pH 9.4工作液,每10 mL加15 mg的ATP鈉鹽,充分溶解,調(diào)節(jié)pH值至9.4。將未經(jīng)固定的新鮮組織冰凍切片自然晾干,在pH 10.4的工作液中孵育5 min,傾去孵育液,在pH 9.4的工作液中孵育30 min,傾去孵育液,用CaCl2溶液清洗3 次,每次2 min。再用質(zhì)量分數(shù)1%硫化銨溶液處理30 s,流水沖洗5 min。將切片依次浸入無水乙醇3 次,每次5 min;后浸入二甲苯2 次,每次5 min,中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察,采集圖像。
1.3.8 基因相對表達量測定
按照動物組織RNA提取試劑盒說明書提取背最長肌、腰大肌和半膜肌的RNA。對提取的牦??俁NA用微量核酸蛋白測定儀分析測定OD260nm/OD280nm及其質(zhì)量濃度,對符合質(zhì)量要求的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒的說明步驟去除總RNA樣品中殘存的基因組DNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)程序為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保溫,之后將cDNA放入-20 ℃冰箱保存,用于實時熒光定量PCR測定。本實驗選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,MYH7、MYH2、MYH1、MYH4為目的基因,分別編碼肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)-I、MyHC-IIa、MyHC-IIb和MyHC-IIx,全部實時熒光定量PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計合成,引物序列如表1所示。
表 1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study
實時熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μL,按照試劑盒要求進行PCR反應(yīng)液的配制,每個反應(yīng)管3 個平行。反應(yīng)程序參照試劑盒說明書。采用操作相對簡便的2-?Ct法作為相對基因表達量的分析方法[23],標準曲線通常被用來確定實時熒光定量PCR反應(yīng)的擴增效率,目的基因相對于內(nèi)參基因的表達為ΔCt,ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。
采用Bio-Rad CFX Manager軟件對熒光定量基因表達數(shù)據(jù)進行相對定量處理以及分析基因的相對表達量。采用Image-Pro Plus version 6.0軟件測定肌節(jié)長度和肌纖維數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析,品質(zhì)指標以肌肉部位為固定效應(yīng)進行單因素方差分析;肌纖維直徑、面積比、數(shù)目比和基因相對表達量以肌纖維類型和肌肉部位為固定效應(yīng)進行兩因素的方差分析。數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。用SPSS 18.0軟件的皮爾森相關(guān)性分析來描述肌纖維特性和肉品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。采用Sigma Plot 12.5軟件作圖。
如表2所示,牦牛不同肌肉部位間的品質(zhì)指標存在明顯差異。3 個肌肉部位的pH值在5.4~5.7范圍內(nèi),腰大肌的pH值顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。肉色是影響消費者購買的主要因素,3 個肌肉部位的L*值沒有顯著性差異(P>0.05),腰大肌的a*值顯著高于背最長?。≒<0.05),這與前人研究結(jié)果一致,其發(fā)現(xiàn)腰大肌含有較高的肌紅蛋白含量,且線粒體含量豐富[16]。腰大肌剪切力顯著低于背最長肌和半膜肌(P<0.05),剪切力背最長?。景肽ぜ。狙蠹?,同時腰大肌的肌節(jié)長度為2.1 μm,顯著高于另兩個部位(P<0.05),由此說明腰大肌嫩度優(yōu)于背最長肌和半膜肌。蒸煮損失率是反映牛肉保水性的一個重要指標,研究表明極限pH值對牛肉保水性具有一定影響[24],pH值下降造成的乳酸積累會破壞蛋白質(zhì)與水的結(jié)合并造成肌絲表面靜電荷的減少,從而不利于水分的保持。本研究發(fā)現(xiàn)半膜肌的pH值較低,同時蒸煮損失(27.2%)顯著高于背最長肌和半膜?。≒<0.05),由此說明半膜肌的保水性較差,而背最長肌保水性較好??傮w來看,綜合剪切力、肉色、蒸煮損失率、肌節(jié)長度和pH值的結(jié)果,腰大肌肉色較紅、嫩度較好,更能滿足人們對高品質(zhì)牛肉的需求。
表 2 牦牛肉背最長肌、腰大肌和半膜肌品質(zhì)指標分析Table 2 Meat quality traits of yak Longissimus lumborum, Psoas major and Semimembranosus
圖 1 牦牛肉背最長肌、半膜肌和腰大肌ATPase組織化學(xué)染色Fig. 1 Histological sections of three muscles stained for myosin ATPase activity
圖 2 牦牛肉肌纖維特性分析Fig. 2 Myofiber characteristics of yak meat
圖1和圖2所示為牦牛3 個肌肉部位的肌纖維特性。如圖2A所示,腰大肌肌纖維直徑(23.9 μm)顯著低于另兩個部位(P<0.05),I型肌纖維直徑和肌纖維面積比均顯著低于II型肌纖維(P<0.05)(圖2B、C)。有研究指出不同肌肉中的肌纖維組成不一,對肉的嫩度會產(chǎn)生一定影響。對于同一品種、同一部位肌肉而言,肌纖維直徑越粗,橫截面積越大,肉塊測得的剪切力就越大,肉的嫩度就越差[25]。肌肉部位和肌纖維類型的交互作用顯著影響肌纖維數(shù)目比(P<0.05),腰大肌I型肌纖維數(shù)目比為50.8%,顯著高于另兩個部位(P<0.05),其中背最長肌最低,為27.2%,這與Hwang等[26]的研究結(jié)果一致,其報道指出韓牛腰大肌具有較高比例的I型肌纖維數(shù)目比,較低比例的IIB型肌纖維數(shù)目比。
有研究指出基于mATPase和代謝酶分類可能存在不一致性,因為所使用組織化學(xué)反應(yīng)強度不同,并且這種方法難以從混合肌纖維IIA/X中分出單一肌纖維類型,在堿性mATPase染色結(jié)果中強烈反應(yīng)的可能是IIA/X混雜纖維[27],故本研究只根據(jù)肌纖維的收縮特性分為II型肌纖維和I型肌纖維,然后測量肌纖維類型的數(shù)目比、面積比以及肌纖維直徑。本研究結(jié)果說明不同部位牦牛肉肌纖維的特性差異顯著。
圖3結(jié)果顯示背最長肌、腰大肌和半膜肌3 個肌肉部位均呈現(xiàn)肌球蛋白重鏈的3 種亞型,即MyHc-I、MyHc-IIa和MyHc-IIx。不同肌肉部位中這幾種亞型的基因相對表達量不同。圖3A為牦牛這3 個部位的MyHcmRNA相對表達量,可以看出腰大肌和半膜肌MYH7mRNA相對表達量均顯著高于MYH2和MYH1(P<0.05),而背最長肌這幾種基因的mRNA相對表達量沒有差異,其中腰大肌MYH7mRNA的相對表達量顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。圖3B為mRNA相對表達量所占比例,可以看出腰大肌MYH7mRNA相對表達量所占比例較高,其次為半膜肌和背最長肌。這與前面肌纖維染色結(jié)果相一致,由此可以得出腰大肌的I型肌纖維較II型肌纖維數(shù)目較多。通過實時熒光定量PCR技術(shù)來分析牦牛這3 個肌肉部位的肌球蛋白重鏈(MyHc)mRNA的相對表達量,驗證了牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌中II型肌纖維和I型肌纖維的比例。此外本研究表明MYH4mRNA在牦牛這3 個肌肉部位中未表達,這與前人研究結(jié)果相似,有研究指出在大多數(shù)牛種中,并沒有在其骨骼肌中發(fā)現(xiàn)MYH4mRNA的表達,僅在個別牛種眼肌中發(fā)現(xiàn)過其表達[28]。
圖 3 背最長肌、腰大肌和半膜肌肌纖維相關(guān)基因mRNA表達量(A)和不同基因mRNA相對表達量所占比例(B)Fig. 3 Relative mRNA expression levels of myofiber-related genes (A)and their distribution (B) in Longissimus thoracis, Psoas major and Semitendinosus
表3顯示牦牛肉肌纖維特性和肉品質(zhì)指標之間的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明II型肌纖維數(shù)目比與剪切力呈極顯著正相關(guān),而II型肌纖維和I型肌纖維直徑均與剪切力呈顯著正相關(guān),與肌節(jié)長度呈顯著負相關(guān)。I型肌纖維數(shù)目比和面積比與肌節(jié)長度呈顯著正相關(guān),相反地,II型肌纖維數(shù)目比和面積比與肌節(jié)長度呈顯著負相關(guān)。
肌纖維是骨骼肌的基本構(gòu)成單位,肌纖維的生物學(xué)特性與肉品質(zhì)如嫩度、pH值和肉色直接相關(guān),肌纖維的類型、數(shù)目和直徑對肉品質(zhì)有重要影響[14],其中嫩度是決定肉品質(zhì)的一個重要因素,研究指出不同肌纖維類型的組成及直徑對肉的嫩度具有一定的影響,一方面肌纖維類型、直徑、橫截面積等方面與肉的嫩度間存在相關(guān)性,肌纖維的直徑越小,肉嫩度也越好;另一方面,不同的肌纖維類型造成了其結(jié)締組織和肌內(nèi)脂肪的含量不同,從而也影響了肉的嫩度,但目前關(guān)于牛肉嫩度和肌纖維特性的關(guān)系仍存在爭議[29-30]。王莉[18]報道牦牛I型肌纖維比例越高,嫩度越好,與本研究結(jié)果一致,因此可以通過增加I型肌纖維的比例來改善肉的嫩度。
表 3 牦牛肉肌纖維特性與3 種部位肌肉品質(zhì)相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients between myofiber characteristics and meat quality traits for three yak muscles
I型和IIA型肌纖維均包含較多的肌紅蛋白含量[8],從而導(dǎo)致肉色較紅,但在本研究中沒有將II型肌纖維明確分類為IIA和IIB型,故肌纖維特性和a*值之間沒有相關(guān)性,而II型肌纖維面積比與L*值呈顯著正相關(guān)(r=0.516;P<0.05)。肌肉中肌纖維類型的組成對宰后蛋白質(zhì)的降解、糖酵解速率以及pH值下降速率有一定的影響,快收縮IIB型肌纖維含有高的糖酵解纖維,導(dǎo)致其在宰后早期代謝速率較快。如果快速收縮酵解型肌纖維在肌肉中占主導(dǎo),則會誘導(dǎo)快速糖酵解,造成肌肉中pH值的快速降低,從而導(dǎo)致汁液滲出,這在豬肉研究中比較常見,這是由于豬肉較牛肉含有更高比例的II型肌纖維;然而在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)pH值和肌纖維特性之間存在顯著的相關(guān)性。II型肌纖維數(shù)目比與蒸煮損失率呈顯著負相關(guān)(r=-0.554,P<0.05)。以上結(jié)果表明,牦牛3 個部位的肌纖維特性和肉品質(zhì)是密切相關(guān)的。
牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌品質(zhì)指標差異明顯,其中腰大肌的pH值和a*值較高,嫩度優(yōu)于背最長肌和半膜肌,而背最長肌的保水性較好,腰大肌居中,總體來說腰大肌的肉品質(zhì)較好。3 個肌肉部位的肌纖維特性差異顯著(P<0.05),其中背最長肌和半膜肌具有較高比例的II型肌纖維,而腰大肌具有較高比例的I型肌纖維和較小的肌纖維直徑。I型肌纖維的數(shù)目比和面積比與肉品質(zhì)性狀存在一定的相關(guān)性。肌纖維數(shù)目比與剪切力呈負相關(guān),與肌節(jié)長度、蒸煮損失呈正相關(guān),而肌纖維面積比與L*值呈顯著負相關(guān)。II型肌纖維和I型肌纖維直徑均和肉的嫩度密切相關(guān)(與剪切力呈正相關(guān)和肌節(jié)長度呈負相關(guān))。本研究結(jié)果表明牦牛的肌纖維特性可以作為衡量牦牛不同肌肉部位品質(zhì)的重要指標,可以通過提高肌肉中I型肌纖維的所占比例,來改善牦牛肉的品質(zhì)。