鄰苯二甲酸二丁酯的光敏毒性作用及機(jī)制

李志軍，包海鷹*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及開發(fā)利用重點(diǎn)研究室，食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是鄰苯二甲酸的酯化衍生物。作為塑化劑，PAEs被廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、油墨的生產(chǎn)中，同時(shí)也可添加于驅(qū)蟲劑、發(fā)膠噴霧劑、指甲油和火箭燃料中，但PAEs對(duì)人類健康具有嚴(yán)重危害[1]。PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物，在食品、飲用水、人體體液中被不同程度檢出[2]。美國國家環(huán)保局將PAEs列為環(huán)境優(yōu)先污染物，同時(shí)其也被人們稱為“第二個(gè)全球性多氯聯(lián)苯污染物”。PAEs經(jīng)口進(jìn)入人體后主要以水解產(chǎn)生單酯的形式被吸收，單酯被認(rèn)為是產(chǎn)生毒性的主要化合物。哺乳動(dòng)物腸黏膜細(xì)胞中的腸酯酶及小腸中的細(xì)胞外膜可將PAEs水解成單酯[3]，如鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）進(jìn)入體內(nèi)后可水解為鄰苯二甲酸單丁酯（mono-n-butylphthalate，MBP）。PAEs被吸收后主要以蛋白結(jié)合體的形式通過血液分布于全身各器官[4]。PAEs類化合物感染大鼠后，在大鼠肝臟、腎臟、心臟、肺、睪丸等各臟器中均可檢出其原型及代謝產(chǎn)物，甚至還可以通過血腦屏障在腦組織中檢出[5]。研究表明，MBP生物活性更高、毒性更強(qiáng)，其不僅對(duì)生殖、發(fā)育、體內(nèi)激素、核受體、炎癥和肥胖等方面都能產(chǎn)生影響，甚至還可以致死、致畸、致突變[6]；因此MBP成為PAEs毒性研究的新熱點(diǎn)[7-11]。MBP灌胃染毒大鼠后，肝臟和腎臟中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量較高，谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量較低。MBP的暴露與大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷存在直接聯(lián)系[12-13]。據(jù)Cao Yuchun[14]和白璐[15]等報(bào)道，在食用膠質(zhì)菌中含有天然的PAEs類物質(zhì)并具有光敏活性，但目前尚鮮見對(duì)DBP導(dǎo)致的光敏體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及機(jī)制的研究。本研究以DBP為對(duì)象，從自由基損傷和肝臟、腎臟毒性角度探討DBP的光敏毒性、致毒機(jī)制和體內(nèi)代謝過程，以期為全面評(píng)價(jià)PAEs對(duì)人體健康的影響提供更豐富的信息，為全面了解PAEs毒性提供依據(jù)，為安全性評(píng)價(jià)和毒性機(jī)制的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量200～220 g）購自吉林大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-0003。

DBP標(biāo)準(zhǔn)品、MBP標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%） 美國Sigma公司；甲基叔丁基醚（純度≥99.0%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸、三氯乙酸、氯仿（均為分析純）、甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；1K15高速離心機(jī) 美國Sigma公司；MVS.1漩渦混合器 北京北德科學(xué)器材有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；ME204E型萬分之一天平梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；電子轟擊質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；電噴霧離子源浙江好創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；RM2126RT切片機(jī)德國Leica公司；BX51光學(xué)顯微鏡（附帶DP75數(shù)碼相機(jī)） 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 DBP和MBP質(zhì)量濃度的測定

色譜柱：C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液。梯度條件：0～5 min，80%～95% A；5～9 min，95%～100% A；9～10 min，100% A；10～13 min，100%～80% A；13～15 min，80% A。流速：0.25 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 DBP體外實(shí)驗(yàn)

對(duì)6 只健康Wistar雄性大鼠眼眶取血10 mL，置于肝素化的離心管中，3 000×g離心15 min，吸取血清4 mL作為空白。分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中，避光30 ℃放置12 h（避光組）；分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中，置于日光下12 h（日光組）。3 000×g離心15 min，取血清0.2 mL，添加0.6 mL甲醇，漩渦振蕩1 min，離心，上清液70 ℃下烘干，再用0.2 mL甲醇超聲溶解，離心，微孔濾膜過濾。取上清液10 μL，按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質(zhì)量濃度。

1.3.3 DBP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 DBP血藥濃度的測定

對(duì)大鼠一次性給予2 000 mg/kgmbDBP灌胃染毒。對(duì)照組以等體積玉米油進(jìn)行灌胃。分別設(shè)置避光組和日光組，避光組置于暗室中，調(diào)節(jié)暗室內(nèi)溫度與室外一致，日光組置于室外日光下，每組6 只大鼠。大鼠灌胃后分別于5、15、30、45 min和1、2、3、4、5、8、12、24、48 h眼眶取血0.8 mL，置于肝素化的離心管中，3 000×g離心15 min，取血清0.2 mL，添加0.6 mL甲醇，漩渦振蕩1 min，離心，上清液70 ℃下烘干，再用0.2 mL甲醇超聲溶解，離心，微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 MBP組織分布的測定

按1.3.3.1節(jié)方法對(duì)大鼠灌胃進(jìn)行200 mg/kgmbMBP染毒。溶劑對(duì)照組以等體積玉米油進(jìn)行灌胃。日光組和避光組分別設(shè)置為5、15、30、45 min和1、2 h組，每組6 只大鼠。各組大鼠經(jīng)灌胃染毒后觀察并記錄體征變化。染毒結(jié)束后處死大鼠，分取肝臟、心臟、肺、腎臟和脾臟。臟器用生理鹽水沖洗表面血跡，濾紙吸干，稱質(zhì)量，磨碎。用20 mL甲醇超聲提取，取上清液1 mL，烘干，再用0.2 mL甲醇超聲提取，離心，微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定MBP質(zhì)量濃度。

1.3.3.3 臟器損傷相關(guān)指標(biāo)的測定

按1.3.3.2節(jié)方法對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒，日光組和避光組分別設(shè)置為5、15、30、45 min和1、2 h組，每組6 只大鼠。對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血，以灌胃染毒前采血樣品為空白對(duì)照，離心10 min后吸出上層血漿，分別檢測血漿中MDA、GSH、ROS含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力。隨后取大鼠的部分肝臟和腎臟組織，先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液漂洗，然后稱取適量組織，加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，低溫離心后取上清液，參考文獻(xiàn)[13]測定ROS、GSH、MDA含量和SOD活力。

1.3.3.4 組織病理學(xué)變化觀察

按1.3.3.2節(jié)方法對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒，取大鼠部分肝臟和一側(cè)的腎臟，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。

1.3.3.5 代謝樣品的采集

取健康Wistar雄性大鼠12 只，隨機(jī)分為避光組和日光組，每組各6 只。分置于代謝籠中，給藥前禁食，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食與飲水。以2 000 mg/kgmbDBP給大鼠灌胃染毒。分別收集避光組與日光組給藥前（空白）及給藥后0～4、4～8、8～12、12～24 h各時(shí)間段的尿樣和糞樣，記錄尿樣體積，置于－80 ℃保存待測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和簡單相關(guān)性分析。用SIMCA-P 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBP體外實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

圖 1 MBP和DBP的液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of MBP and DBP

圖1結(jié)果表明，DBP與血清混合后，在避光和日光下放置12 h均有MBP生成。但DBP與生理鹽水混合后，在避光和日光下放置12 h均無MBP的生成。在空白血清中沒有檢測到MBP和DBP。對(duì)MBP進(jìn)行分離，其電子轟擊質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖 2 MBP的電子轟擊質(zhì)譜圖Fig. 2 Electron impact mass spectrum of MBP

2.2 DBP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

圖 3 DBP和MBP在大鼠體內(nèi)的質(zhì)量濃度變化Fig. 3 Changes in blood concentrations of DBP and MBP in rats

對(duì)大鼠單獨(dú)灌胃1/10半數(shù)致死量的DBP后，DBP在大鼠體內(nèi)的質(zhì)量濃度變化見圖3。隨著時(shí)間的延長，DBP在大鼠血液中的質(zhì)量濃度不斷增加，在15 min左右避光組與日光組出現(xiàn)最大值，避光組為0.063 μg/mL，日光組為0.026 μg/mL；之后DBP質(zhì)量濃度均下降，到3 h左右避光組出現(xiàn)第2個(gè)峰值（0.017 μg/mL）；同時(shí)，根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，從大鼠血液中還檢測到MBP。日光組大鼠在2 h左右全部死亡，其血液中的MBP質(zhì)量濃度高于避光組大鼠，在2 h時(shí)達(dá)到0.133 μg/mL。避光組大鼠血液中的MBP質(zhì)量濃度在1 h時(shí)出現(xiàn)最大值（0.054 μg/mL），之后趨于平穩(wěn)，12 h后開始下降，24 h左右MBP質(zhì)量濃度降到0.001 μg/mL。

2.2.2 MBP在大鼠體內(nèi)的分布

大鼠灌胃DBP并在日光下照射2 h左右后出現(xiàn)急性中毒死亡，因此選擇將組織分布實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)計(jì)在0～2 h。DBP灌胃大鼠后主要以水解產(chǎn)生MBP的形式被吸收，因此以MBP作為研究對(duì)象。圖4結(jié)果表明，MBP灌胃大鼠后，避光條件與日光條件下，肝臟與腎臟中MBP質(zhì)量濃度均高于脾、肺和心臟。肝臟和腎臟在避光條件與日光條件下MBP分布表現(xiàn)出較大差異：在避光條件下，肝臟中MBP質(zhì)量濃度在45 min左右達(dá)到最大值（0.030 μg/mL），然后趨于平穩(wěn)；腎臟中MBP質(zhì)量濃度在45 min左右達(dá)到最大值（0.254 μg/mL），之后趨于平穩(wěn)；日光組肝臟與腎臟中MBP質(zhì)量濃度均在30 min左右達(dá)到最大值，肝臟中為0.048 μg/mL，腎臟中為0.043 μg/mL，之后MBP質(zhì)量濃度先下降后趨于平穩(wěn)。

圖 4 MBP在大鼠體內(nèi)的分布Fig. 4 Distribution of MBP in rats

2.2.3 臟器損傷相關(guān)指標(biāo)的測定

表 1 MBP對(duì)大鼠肝臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 1 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat liver

由表1、2可見，與空白對(duì)照組相比，避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中的ROS和MDA含量均升高，但灌胃30 min后日光組ROS含量明顯高于避光組。避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中GSH含量和SOD活力均降低，但灌胃15 min后日光組明顯低于避光組。

表 2 MBP對(duì)大鼠腎臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 2 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat kidney

2.2.4 大鼠肝臟組織切片觀察結(jié)果

圖 5 大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果（×100）Fig. 5 Hematoxylin eosin staining of liver tissue（× 100）

以200 mg/kgmbMBP灌胃后，在顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色的大鼠肝臟組織細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞的損傷程度與光照時(shí)間存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，大鼠肝細(xì)胞在日光下2 h損傷最明顯。由圖5可看出，避光組灌胃MBP后5 min～2 h內(nèi)，肝臟細(xì)胞均以中央靜脈為中心向外呈輻射狀排列，肝竇狀隙規(guī)則分布且細(xì)胞排列較為密實(shí)，肝臟細(xì)胞損傷不明顯（圖5A～D）。日光組在灌胃MBP后30 min左右肝細(xì)胞局部伴隨輕微炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞核輕微固縮、局部胞漿空亮和局部細(xì)胞腫大等癥狀；隨著時(shí)間的延長，在1 h左右出現(xiàn)部分肝細(xì)胞水腫、細(xì)胞核固縮、破裂、水解癥狀；2 h左右肝細(xì)胞出現(xiàn)胞漿空亮、核消失、空泡樣變、脂肪滴增大融合、局部細(xì)胞嚴(yán)重壞死癥狀，說明肝細(xì)胞存在嚴(yán)重的氧化損傷（圖5E～H）。因此，在日光下MBP對(duì)大鼠肝臟的損傷程度高于避光條件。

2.2.5 大鼠腎臟組織切片觀察結(jié)果

丹皮酚對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 ………………………………… 吳 琪等（11）：1500

圖 6 大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果（×100）Fig. 6 Hematoxylin eosin staining of kidney tissue（× 100）

顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn)，與肝臟組織細(xì)胞相比，日光組大鼠腎臟組織細(xì)胞同樣發(fā)生了嚴(yán)重的組織損傷。灌胃MBP后，避光組大鼠（圖6A～D）出現(xiàn)了局部腎小管上皮細(xì)胞脫落、水樣變性等癥狀，但大鼠腎臟病理切片可見腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，系膜區(qū)無增生及沉積物，基底膜未見病變；隨著時(shí)間的延長，在2 h左右細(xì)胞腎小囊管腔變窄，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤等癥狀。日光組大鼠（圖6E～H）灌胃MBP后1 h左右，出現(xiàn)了腎小體數(shù)目減少、腎小囊管腔變窄、淋巴細(xì)胞浸潤程度增大等癥狀，且損傷程度明顯高于避光組。結(jié)果表明日光能夠加重MBP對(duì)大鼠的腎臟損傷。

2.2.6 DBP對(duì)大鼠排泄的影響

大鼠灌胃DBP后，其主要以MBP的形式從尿液中排泄，且在尿液中沒有檢測到DBP，避光組0～4 h時(shí)尿液中MBP質(zhì)量濃度為0.427 μg/mL，4～8 h時(shí)為0.164 μg/mL，8～12 h時(shí)為0.455 μg/mL，12～24 h時(shí)為0.560 μg/mL。日光組0～4 h時(shí)尿液中MBP質(zhì)量濃度為0.132 μg/mL，4～8 h時(shí)為0.069 μg/mL，8～12 h時(shí)為0.291 μg/mL，12～24 h時(shí)為0.099 μg/mL。在0～24 h內(nèi)，避光組大鼠尿液中MBP質(zhì)量濃度高于日光組（圖7A）。MBP和DBP在大鼠糞便中均被檢出（圖7B），且0～24 h內(nèi)避光組大鼠糞便中DBP和MBP質(zhì)量濃度均大于日光組。結(jié)果表明與日光組相比較，避光組大鼠體內(nèi)DBP更容易代謝排出體外。

圖 7 大鼠排泄物中DBP、MBP的質(zhì)量濃度變化Fig. 7 Changes in urinary and fecal concentrations of DBP and MBP in rats

3 討 論

PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物，其中DBP是我國最常使用的增塑劑之一，其可通過飲食攝入、呼吸道吸入和皮膚接觸等途徑對(duì)人體造成危害[16]，可導(dǎo)致過敏性皮炎[17]以及生殖[18]、神經(jīng)、肝臟、腎臟和心臟等多種器官系統(tǒng)的損傷[17-23]。DBP導(dǎo)致肝細(xì)胞過氧化物酶增多、肝腫大的問題曾引起專家的重視，盡管該作用機(jī)制還不是十分明確，但是過氧化物酶增生和肝腫大通常發(fā)生在腫瘤形成之前[24]。近年來，有研究者通過測量尿液中DBP代謝物MBP的含量來間接反映DBP的接觸水平，基于樣品的易得到性和檢測方法的成熟性，認(rèn)為MBP是一種較合適的反映DBP暴露的生物標(biāo)志物[25]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用對(duì)比研究，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)DBP的光敏毒性進(jìn)行研究，旨在找出DBP與光照的關(guān)聯(lián)性以及DBP在光照下毒性加劇的機(jī)理，從整體上闡明光照條件對(duì)大鼠的毒性作用及代謝調(diào)控機(jī)制。本研究采用高效液相色譜法檢測了在光照和避光條件下大鼠體外、體內(nèi)血清中DBP和MBP的質(zhì)量濃度。體外血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DBP在大鼠血清中轉(zhuǎn)化為MBP，與是否光照無關(guān)。因此，對(duì)于MBP在日光下是否會(huì)加劇對(duì)大鼠的毒性作用以及機(jī)理進(jìn)行研究。大鼠代謝實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)口灌胃DBP，其可迅速經(jīng)胃腸道吸收，經(jīng)小腸內(nèi)的非特異性酶代謝成穩(wěn)定的MBP，MBP和其他代謝產(chǎn)物與葡糖普酸結(jié)合后隨尿液排出[3]。大鼠經(jīng)口給予MBP后，在心臟、肝臟、脾、肺和腎臟中均能檢測到DBP，但肝臟和腎臟中MDP質(zhì)量濃度明顯高于其他臟器。

Jurczuk等的研究表明，ROS超過一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)其他生物分子產(chǎn)生不利影響[26]，因此ROS的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)是MBP造成肝臟和腎臟炎癥的主要方式。在灌胃MBP后，日光組大鼠的肝臟和腎臟組織GSH含量下降，這可能是由于MBP持續(xù)氧化產(chǎn)生應(yīng)激產(chǎn)物ROS所引起，同時(shí)GSH由于去除過氧化氫而被消耗。王立蓉等研究表明，細(xì)胞GSH含量降低到一定程度時(shí)，細(xì)胞會(huì)受到不可逆損傷[27]。MDA在機(jī)體的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用，可以造成膜的流動(dòng)性與通透性的改變，導(dǎo)致異常生理生化反應(yīng)與免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。SOD可以保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基的損傷，能夠清除H2O2和·OH。當(dāng)MDA含量升高、SOD活力降低時(shí)，可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致某些細(xì)胞的死亡[28]。對(duì)染毒大鼠肝臟和腎臟中關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，ROS和MDA的含量與MBP染毒后光照時(shí)間呈正相關(guān)，GSH含量和SOD活力與MBP染毒后光照時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；相同劑量MBP染毒后，與避光組相比，日光組大鼠血清中ROS和MDA含量較高，GSH含量和SOD活力較低，表明光照能加劇MBP對(duì)大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷。

肝臟和腎臟的HE染色病理切片觀察結(jié)果表明，染毒后隨著時(shí)間的延長，日光組大鼠肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、細(xì)胞水腫、空泡樣變、脂肪滴增大融合等癥狀，而避光組損傷程度相對(duì)較輕，結(jié)果表明日光能夠加劇MBP對(duì)大鼠肝臟和腎臟的組織損傷。大鼠排泄物的研究結(jié)果表明，光照條件較避光條件下MBP在大鼠體內(nèi)更不易排出體外。說明DBP是一種對(duì)雄性大鼠具有潛在危害的光敏毒性物質(zhì)。

DBP可通過食物、飲水等多種途徑被人體攝入[29]。張鵬等研究表明，在膠陀螺中含有一定量的天然DBP[30]，且近年來更有膠質(zhì)菌食用不當(dāng)而引發(fā)的急性中毒事件的報(bào)道[31]。李志軍等研究表明，不同的浸泡方式對(duì)黑木耳中DBP含量存在相關(guān)性[32]，膠質(zhì)菌的急性中毒事件可能與膠質(zhì)菌中存在的DBP有關(guān)。本研究證明了DBP的光敏毒性和在體內(nèi)臟器中的分布規(guī)律，應(yīng)重視DBP對(duì)人體的潛在危害，并對(duì)DBP及含有天然DBP食品的健康危險(xiǎn)度做出更全面的評(píng)價(jià)。