馬霞，周延州，郭振環(huán)，趙麗，劉永錄*，王林，張國祖

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省康星生物科技有限公司，河南焦作 454950； 3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，鄭州451464)

玉屏風(fēng)散是元代醫(yī)學(xué)家危亦林所創(chuàng)的名方，主要由黃芪、白術(shù)(炒)、防風(fēng)以3∶1∶1的比例制成，該藥具有益氣固表，滋陰清熱的功效，獸醫(yī)臨床上常用于提高畜禽生長性能，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力[1-3]。超微粉碎可以將植物的細(xì)胞壁破碎，增加有效成分溶出，提高生物利用度，從而降低用藥成本，達(dá)到最好的用藥效果[4-5]。玉屏風(fēng)超微粉就是將玉屏風(fēng)散通過超微粉碎技術(shù)得到的新劑型。

為考察玉屏風(fēng)散經(jīng)過超微粉碎后有效成分的溶出情況，實驗以黃芪中有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷為標(biāo)示成分進(jìn)行研究。首先建立玉屏風(fēng)超微粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量檢測方法，為達(dá)到模擬動物機(jī)體胃環(huán)境的目的，試驗選用人工胃液為溶出介質(zhì)，采用漿法測定玉屏風(fēng)超微粉和散劑中標(biāo)示成分的溶出率，從而為玉屏風(fēng)超微粉的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀(型號P230，大連伊力特公司，配制紫外檢測器)；藥物溶出儀(型號RCZ-1A，上海黃海藥檢儀器有限公司)；萬分之一電子天平(型號AUW220D1，島津國際貿(mào)易有限公司)；超聲波清洗器(型號KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(含量97.9%中國食品藥品檢定研究院，批號11920-201102)；玉屏風(fēng)散(批號20180403)、玉屏風(fēng)超微粉(批號為20180403的玉屏風(fēng)散超微粉碎，按企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)采用激光粒度分析儀檢測小于48 μm的粒度百分比為95%)均由河南省康星藥業(yè)股份有限公司研發(fā)中心制備提供；純化水(Minipore 純水器制備)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、鹽酸等為分析純，均購自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 HPLC檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%甲酸(35∶65)；柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長為260 nm。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于3000。

1.2.2 對照品溶液的配制[6]精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，放入容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為50 μg/mL的對照品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取2、5、10、15、20 μL對照品溶液注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品的制備及檢測[6]分別取玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散各2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀，計算玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

1.2.5 專屬性試驗 依據(jù)處方中的比例，制備缺黃芪的陰性樣品，按樣品的制備方法制備陰性溶液，注入高效液相色譜儀，與對照品溶液、樣品溶液圖譜進(jìn)行對比，考察方法的專屬性。

1.2.6 精密度和重復(fù)性的考察 分別精密吸取對照品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察系統(tǒng)精密度。同一批次樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察方法重復(fù)性。

1.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出率測定

1.3.1 人工胃液的配制[7]取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1000 mL，即得，檢測pH值為1.8。

1.3.2 漿法測藥物溶出度 調(diào)整溶出儀參數(shù)，使溶出儀槳葉底部距溶出杯的內(nèi)底部25 mm，加入人工胃液500 mL，開啟溫度控制。待人工胃液溫度恒定到37℃時，分別取玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散各15 g加入溶出儀中，以50 r/min轉(zhuǎn)速啟動溶出儀，并開始計時。于加入藥物后0.083、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24、30 h，分別取樣品溶液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀檢測。每次取樣后補充1 mL同溫度人工胃液至溶出儀中。計算各時間點毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出的總量，以總含量為參比，計算各時間點的累積溶出百分率，繪制溶出曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量檢測方法的建立 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、不含黃芪陰性樣品、玉屏風(fēng)超微粉的液相色譜圖分別見圖1～圖3。從色譜圖看出，毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時間在約10 min位置，陰性樣品無雜質(zhì)峰干擾，分離度良好，說明該方法特異性較好。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1023.3x+11.317，線性系數(shù)r為0.9996，說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.1～1 μg含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗的RSD為0.86%，說明該方法精密度良好。重復(fù)性試驗的RSD為1.57%，說明方法的重復(fù)性較好，滿足含量測定要求。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品Fig 1 The reference substance of Hairy Isoflavone Glucoside

圖2 不含黃芪的陰性樣品Fig 2 Negative samples without Astragalus

圖3 玉屏風(fēng)超微粉樣品Fig 3 The sample of Yupingfeng Utra-micropowder

2.2 玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散含量檢測結(jié)果 經(jīng)高效液相色譜儀檢測，同批次的玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散的含量分別是0.256和0.248 mg/g，超微粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量比散劑含量提高3%，說明，藥物經(jīng)超微粉碎后，有效成分溶出更多。

2.3 玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散溶出率比較 分別檢測各時間點人工胃液中藥物濃度，計算累積溶出率，結(jié)果見圖4。圖4可看出，將藥物加入溶出儀中后，超微粉和散劑的毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積溶出率在5 min時差別不明顯散劑。超微粉的最快溶出時間段在0～2 h，溶出速度明顯高于散劑，2 h后累積溶出率緩慢增加，最后在16 h達(dá)到平衡，累積溶出率為80.36%。散劑的最快溶出時間段在0～6 h，6 h后累積溶出率緩慢增加，最后也在16 h達(dá)到平衡，累積溶出率為77.51%。

圖4 兩種劑型的累積溶出率曲線圖Fig 4 The cumulative dissolution rate curve graph of two dosage forms

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測方法的建立 試驗建立了玉屏風(fēng)散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的高效液相色譜檢測方法，其色譜條件為流動相：乙腈-0.2%甲酸(35∶65)，避開了中華人民共和國獸藥典(二部)[6]中的梯度洗脫方法，簡單方便，操作性強(qiáng)。而且該方法特異性較好，無黃芪陰性樣品無雜質(zhì)峰干擾，樣品峰分離度良好，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.1～1 μg含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法的精密度、重復(fù)性較好，滿足含量測定要求，可用于玉屏風(fēng)散或玉屏風(fēng)超微粉的質(zhì)量控制或相關(guān)含量研究。

3.2 玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散含量檢測 玉屏風(fēng)超微粉與散劑相比，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量提高了3%，可能是細(xì)胞壁在粉碎過程中被破壞，有效成分無需穿透細(xì)胞壁即可釋放，釋放速度和釋放量得到提高，能維持藥材原有的藥效。

3.3 玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散溶出率檢測 目前已有不少關(guān)于超微粉藥物溶出率的研究報道，但大多都是選用水為溶出介質(zhì)進(jìn)行試驗[8-9]。本實驗選用人工胃液作為介質(zhì)，更加接近機(jī)體真實狀態(tài)，更能反應(yīng)藥物真實溶出情況。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)超微粉和玉屏風(fēng)散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出率在5 min均能達(dá)到73%，說明超微粉和散劑在人工胃液中溶出均較好，利于提高生物利用度，但超微粉的溶出率在5 min時并不明顯高于散劑，可能是因為藥材經(jīng)超微粉碎后，顆粒在一定程度上比表面積增大，導(dǎo)致分散性和流動性變差，從而在溶劑中更容易聚集，造成藥粉與溶媒接觸的比表面積下降，不利于成分的溶出。

經(jīng)超微粉碎后，粉體粒徑變小、分布均勻、比表面積顯著增大、孔隙率增加、溶解性提高、親和力上升，有利于其藥效成分溶出[10]。試驗也發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)超微粉在2 h時毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積溶出率接近平衡，散劑則在6 h累積溶出率接近平衡，且超微粉累積溶出率也高于散劑，說明藥物進(jìn)入機(jī)體后超微粉比散劑溶出速率高，達(dá)峰時間縮短。

散劑散劑中藥材粉碎成超微粉后，大多數(shù)有效成分如多糖類、皂苷類和黃酮類會溶出速率增加[10]，也有少部分有效成分如生物堿等會溶出減慢，這與溶出介質(zhì)，活性成分理化性質(zhì)，溶解度等緊密相關(guān)[12]。因此超微粉應(yīng)用時，應(yīng)根據(jù)具體用藥情況，制定合理生產(chǎn)和應(yīng)用方案，才能更好發(fā)揮中獸藥超微粉的優(yōu)勢。