許曉琳，潘婷婷，張樹(shù)棟，王傳文，潘保良*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2. 北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 102206)

乙酰氨基阿維菌素(eprinomectin，EPR)是一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代驅(qū)蟲(chóng)藥物[1-2]，主要用于防治家畜(特別是泌乳家畜)的外寄生蟲(chóng)(蜱、虱、螨、蠅)和內(nèi)寄生蟲(chóng)(各種線蟲(chóng))的感染[3-5]。該藥應(yīng)用于奶牛和肉牛時(shí)無(wú)需休藥期[6]。但該藥應(yīng)用于禽類寄生蟲(chóng)的防控尚未見(jiàn)報(bào)道。雞皮刺螨是蛋雞養(yǎng)殖中最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的外寄生蟲(chóng)病，但傳統(tǒng)的藥物防治存在不徹底、耐藥性等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室前期研究EPR對(duì)雞皮刺螨的防控作用發(fā)現(xiàn)，5 mg/kg的給藥劑量可達(dá)到100%的殺螨效率[7]，為了更好地了解EPR在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，本研究建立了雞血漿中EPR濃度測(cè)定的熒光HPLC檢測(cè)方法，并對(duì)其在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，為EPR的制劑開(kāi)發(fā)及在雞皮刺螨防治中的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與設(shè)備 Waters 2695高效液相色譜儀，配有Waters 2475 熒光檢測(cè)器(Waters 公司)；SunFireTMC18反相色譜柱(4.6×150 mm，5 μm；Waters 公司)；Sep-Pak C18固相萃取柱(Waters 公司)；DT5-2型離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；OA-SYS型氮吹儀(Organomation Associates 公司)；渦動(dòng)儀(北京方正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；Sartorius BP310s電子天平(Sartorius公司)。

1.2 試劑與藥品 EPR標(biāo)準(zhǔn)品，純度94.5%，批號(hào)：G157148，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；色譜純的乙腈、甲醇(德國(guó)Merck-KGaA)，N-甲基咪唑、三氟乙酸酐(百靈威)，色譜純的冰乙酸、三乙胺(阿拉丁)；蒸餾水(屈臣氏集團(tuán))。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 6只白羽蛋雞，體重1.3～1.7 kg，年齡為20～22周。所有雞均沒(méi)有使用過(guò)EPR等藥物，雞在雞舍內(nèi)自由飲水、采食，在試驗(yàn)前適應(yīng)一周，并采血檢測(cè)，確定血漿中沒(méi)有EPR。試驗(yàn)前16 h及給藥后6 h內(nèi)禁食禁水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶液制備

2.1.2 衍生化試劑的制備 A 液：N-甲基咪唑+乙腈(2+7，V/V)；B液：三氟乙酸酐+乙腈(2+7，V/V)，A液與B液均現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.3 EPR口服溶液的制備 EPR溶解于乙醇中，以乙醇:吐溫80:PBS(pH=7.4)=40:2:58的比例配置2 mg/mL的EPR溶液。

2.2 EPR的熒光HPLC檢測(cè)方法的建立

2.2.1 血漿樣品的前處理

2.2.1.1 EPR的提取與純化 取空白雞血漿450 μL，加入50 μL EPR標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，加入3 mL乙腈渦動(dòng)混勻2 min，超聲10 min，4000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，下層殘?jiān)? mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液中加入9 mL蒸餾水稀釋并混勻。將稀釋的上清液通過(guò)活化的ODS-C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇進(jìn)行活化，然后用超純水淋洗，再用3 mL 70%甲醇水溶液進(jìn)行平衡)，依次用3 mL蒸餾水和3 mL 70%甲醇水溶液進(jìn)行淋洗，吹干后，使用4 mL甲醇(分3次，分別為2、1、1 mL)進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，使用氮吹儀將液體吹干。

2.2.1.2 熒光衍生化 向干燥的樣品中依次加入200 μL A液、200 μL B液、45 μL冰醋酸和45 μL三乙胺，渦動(dòng)混勻后將其置于65 ℃真空干燥箱內(nèi)反應(yīng)30 min，再依次置于4 ℃冰箱3 min、室溫12 min。用流動(dòng)相定容至1 mL，混勻后過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供HPLC分析。

2.2.2 色譜條件 色譜柱： SunFireTMC18 反相色譜柱；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)463 nm；流動(dòng)相：甲醇:乙腈:水= 63:32:5(V/V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)時(shí)間：12 min。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取雞空白血漿450 μL于離心管中，然后加入不同濃度的EPR標(biāo)準(zhǔn)系列工作液50 μL，使其濃度為0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL，參考方法2.2.1項(xiàng)與2.2.2項(xiàng)進(jìn)行血漿樣品的處理與HPLC檢測(cè)分析。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，繪制出濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

該煤炭企業(yè)風(fēng)選項(xiàng)目初步方案是，從煤場(chǎng)第一部振動(dòng)篩下出料口將8cm以下原煤引入風(fēng)選設(shè)備中，經(jīng)風(fēng)選系統(tǒng)排矸后精煤再返回原煤場(chǎng)篩分第二部振動(dòng)篩內(nèi)，依次分級(jí)為中塊(5-8cm)、小塊(2-5cm)、粒煤(1-3cm)和末煤。風(fēng)選系統(tǒng)與原煤篩分系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合，原煤篩分系統(tǒng)可以單獨(dú)運(yùn)行，也可以與風(fēng)選系統(tǒng)搭配使用。

2.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.4.1 準(zhǔn)確度與精密度的測(cè)定 使用EPR標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配置低、中、高三種血漿濃度添加水平，即0.5、10、100 ng/mL三種血漿添加濃度，同時(shí)配置0.5、10、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的雞血漿樣品經(jīng)過(guò)前處理、衍生化后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，測(cè)出峰面積；標(biāo)準(zhǔn)溶液直接經(jīng)氮吹儀吹干、衍生化與HPLC檢測(cè)，測(cè)出對(duì)應(yīng)的藥物峰面積。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，測(cè)3個(gè)批次，計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(RSD)。

2.2.4.2 檢測(cè)限與定量限 取雞空白血漿5份，參考方法2.2.1項(xiàng)與2.2.2項(xiàng)對(duì)樣品進(jìn)行處理與HPLC檢測(cè)，測(cè)得對(duì)應(yīng)保留時(shí)間位置背景信號(hào)(噪音)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按信噪比(S/N)為3計(jì)算，求得各個(gè)樣品檢測(cè)方法的檢測(cè)限(LOD)。以S/N=10，計(jì)算定量限(LOQ)。

2.3 藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

2.3.1 給藥與采集血樣 在試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物稱重，以5 mg/kg的給藥劑量灌服EPR溶液，在給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h進(jìn)行翅下靜脈采血，12000 r/min離心10 min分離血漿，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。由于本試?yàn)中給藥劑量較大，為了準(zhǔn)確的檢測(cè)雞血漿中的EPR，對(duì)血漿進(jìn)行了稀釋處理。

2.3.2 雞血漿中EPR的濃度測(cè)定 取恢復(fù)至室溫的雞血漿500 μL，對(duì)血漿中的EPR進(jìn)行提取、純化與衍生化，定容后過(guò)濾膜，進(jìn)行HPLC分析。方法參照2.2.1項(xiàng)與2.2.2項(xiàng)。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理 將測(cè)得的各個(gè)血樣的HPLC檢測(cè)值，使用Waters儀器提供的Empower3軟件分析，計(jì)算出各個(gè)血漿樣品中EPR的濃度，繪制出樣品的時(shí)間-藥物濃度散點(diǎn)圖。

采用WinNinlin5.2.1(Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)分析軟件對(duì)樣品的時(shí)間-藥物濃度曲線進(jìn)行模擬分析，以非房室模型分析方法對(duì)藥代數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并求出相應(yīng)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 血漿中EPR濃度-HPLC吸收峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。在濃度為0.1～100 ng/mL添加范圍內(nèi)，EPR峰面積與濃度呈線性相關(guān)。其線性回歸方程為：Y=123938X+23011，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

圖1 EPR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(0.1～100 ng/mL)Fig 1 Standard curve for EPR (0.1～100 ng/mL)

3.2 準(zhǔn)確度與精密度 在雞血漿中，3個(gè)濃度、3個(gè)批次的添加回收率和變異系數(shù)(RSD)見(jiàn)表1。EPR在雞血漿中的添加水平為0.5、10、100 ng/mL時(shí)，平均回收率在90.55%～101.30%之間，批內(nèi)RSD在2.81%～8.02%之間，批間RSD在4.32%～5.83%之間，表明該方法準(zhǔn)確度、精密度高，重復(fù)性好，可達(dá)到分析要求。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

3.3 檢測(cè)限與定量限 通過(guò)添加試驗(yàn)確定本方法的EPR的LOD和LOQ分別為0.1 ng/mL和0.3 ng/mL。

3.4 熒光HPLC色譜分析 EPR標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/mL)色譜圖如圖2。雞空白血漿以及向空白血漿中添加EPR標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/mL)的色譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4。EPR的保留時(shí)間為7.6 min左右，色譜峰分離良好、對(duì)稱性好，EPR峰周圍無(wú)明顯干擾峰，達(dá)到了檢測(cè)的要求。

圖2 EPR標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖(10 ng/mL)Fig 2 Chromatogram of EPR standard solution (10 ng/mL)

圖3 雞空白血漿色譜圖Fig 3 Chromatogram of chicken plasma solution

圖4 雞血漿添加EPR標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖(10 ng/mL)Fig 4 Chromatogram of chicken plasma solution with EPR standard solution (10 ng/mL)

3.5 EPR溶液在雞體內(nèi)的藥代結(jié)果 雞口服5 mg/kg的EPR溶液后，血漿樣品的時(shí)間-EPR藥物平均濃度散點(diǎn)圖見(jiàn)圖5，雞血漿樣品藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。在給藥后1.58 ± 0.38 h，EPR溶液在雞體內(nèi)的最大血藥濃度(Cmax)為354.27 ± 65.99 ng/mL，消除半衰期(T1/2el)為5.52 ± 1.67 h，曲線下面積AUC0-t為2306.55 ± 531.82 ng/mL，AUC0-∞為2348.53 ± 547.16 ng/mL，平均滯留時(shí)間(MRT)為6.40 ± 1.03 h。

圖5 血漿樣品的時(shí)間-EPR藥物平均濃度散點(diǎn)圖(5 mg/kg)Fig 5 Concentration-time profile of EPR in plasma (5 mg/kg)

參數(shù)值(x±SD)Cmax/(ng·mL-1)354.27±65.99Tmax/h1.58±0.38AUC0-t/(ng·h·mL-1)2306.55 ± 531.82AUC0-∞2348.53±547.16MRT/h6.40±1.03T1/2el/h5.52±1.67

Cmax為最大藥物濃度，Tmax為到達(dá)最大藥物濃度的時(shí)間，T1/2el為消除半衰期，AUC0-t為時(shí)間從0到所選擇的最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)曲線下面積，AUC0-∞為時(shí)間從0到無(wú)窮期間的曲線下面積，MRT為藥物的平均滯留時(shí)間

4 討論與結(jié)論

自EPR開(kāi)發(fā)上市以來(lái)，圍繞藥物開(kāi)展了制劑研發(fā)、檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化、藥效試驗(yàn)與藥代試驗(yàn)等研究。目前，EPR澆潑劑、注射劑與口服糊劑等廣泛應(yīng)用于肉牛、奶牛、羊、兔等動(dòng)物，EPR在相應(yīng)動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究已有報(bào)道，但EPR在家禽上的應(yīng)用較少，以及EPR在家禽體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究還未有報(bào)道。本研究為了探討EPR在雞體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，成功建立了雞血漿中EPR的熒光HPLC檢測(cè)方法，并進(jìn)行了雞體內(nèi)EPR藥代動(dòng)力學(xué)研究。

雞血漿中EPR的熒光HPLC方法建立，在Dannher等[8]建立的衍生化方法、潘保良等[9]建立的牛奶中EPR的HPLC檢測(cè)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，用N-甲基咪唑和三氟乙酸酐作為衍生化試劑，加入冰醋酸后，又嘗試加入三乙胺[10]，使EPR的衍生化方法趨于穩(wěn)定，衍生化產(chǎn)物在22 h內(nèi)不發(fā)生明顯的降解，解決了衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定的問(wèn)題。此外，EPR色譜峰分離良好，峰周圍無(wú)明顯干擾峰，滿足檢測(cè)要求。

在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知，EPR溶液經(jīng)口服給雞后，在1.58 h(Tmax)就達(dá)到了血藥濃度峰值(354.27 ng/mL，Cmax)，提示EPR在雞體內(nèi)吸收與分布迅速；EPR在雞血漿中的消除半衰期為5.52 h(T1/2el)，平均滯留時(shí)間為6.40 h(MRT)，說(shuō)明EPR在雞體內(nèi)消除較快。EPR在雞體內(nèi)吸收分布迅速、消除快的特點(diǎn)與阿維菌素類藥物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的藥代的吸收代謝特征存在明顯區(qū)別。據(jù)報(bào)道，EPR澆潑劑(0.5 mg/kg)用于綿羊時(shí)，在給藥后3.13 d可達(dá)到最大血藥濃度6.20 ng/mL，消除半衰期為6.40 d[11]。EPR口服糊劑(0.2 mg/kg)用于泌乳期奶牛時(shí)，在給藥后1.60 d達(dá)到最大血藥濃度30.02 ng/mL，平均滯留時(shí)間為3 d，消除半衰期為1.24 d[12]。EPR注射液(0.2 mg/kg)在泌乳奶牛體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示：在血漿中，EPR在給藥后39 h達(dá)到最大藥物濃度44.0 ng/mL，消除半衰期為164.0 h，平均滯留時(shí)間為211 h[13]。通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)，EPR在雞體內(nèi)的吸收分布與消除均明顯快于EPR在哺乳動(dòng)物[14-15]體內(nèi)的代謝情況。與EPR同屬于阿維菌素類藥物的伊維菌素(IVM)在家禽和哺乳動(dòng)物中的藥代動(dòng)力學(xué)特征也存在類似的區(qū)別。IVM在羊體內(nèi)的藥代結(jié)果顯示[16]，羊皮下注射或口服IVM后，分別在60.0和16.4 h達(dá)到最大血藥濃度30.8和22.0 ng/mL，消除半衰期分別為88.4和10.1 h。而給雞靜脈注射、皮下注射或口服IVM后，在血漿中可達(dá)到的最大血藥濃度分別為316.0 ng/mL、82.9 ng/mL(Tmax=6 h)和10.2 ng/mL(Tmax=3.36 h)，消除半衰期分別為0.37、1.45和0.23 d[17]，其吸收和藥物代謝速度明顯快于哺乳動(dòng)物。IVM、EPR在哺乳動(dòng)物和雞體內(nèi)的藥代結(jié)果表明阿維菌素類藥物在雞體內(nèi)具有吸收分布迅速、消除快的藥代動(dòng)力學(xué)特征。將藥代結(jié)果與前期EPR對(duì)雞皮刺螨的殺螨效率試驗(yàn)[7]相結(jié)合可推測(cè)，在臨床應(yīng)用中，EPR需要通過(guò)多次給藥以達(dá)到徹底清除雞螨蟲(chóng)的目的。此外，由于EPR在雞血漿中代謝消除快，可以有效避免藥物殘留造成的安全問(wèn)題，但EPR在雞不同組織、蛋中的藥物殘留還未知，因此需要開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)來(lái)確定EPR在雞體、蛋中的殘留消除規(guī)律。

本研究首次建立了雞血漿中EPR的HPLC檢測(cè)方法，并開(kāi)展了EPR在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，為EPR防治雞螨蟲(chóng)新制劑研制與臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。