劉少寧，李有志，王艷芬，李淑花，王燕，徐恩民

(山東省獸藥質量檢驗所，山東省畜產品質量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室，濟南 250022)

多拉菌素(Doramectin)是新一代大環(huán)內酯類抗寄生蟲藥物，屬伊維菌素的衍生物。主要用于治療胃腸道蛔蟲，肺蠕蟲，眼絲蟲，虱和疥螨等引起的寄生蟲病[1-2]。固相萃取技術(solid phase extraction，SPE)是近年發(fā)展起來的一種樣品預處理技術，其原理是利用組分與吸附劑(固定相)間選擇性吸附與選擇性洗脫的過程，達到提取分離、凈化和富集的目的。當應用于性狀為油狀的獸藥產品檢測時，其分離效果較好。多拉菌素注射液性狀為無色或微黃色的油狀液體，收載在2017版《獸藥質量標準》化學品卷，標準【含量測定】中標注的LC-Si固相萃取柱(4.6×150 mm，5 μm)難以購買，且不適合常用固相萃取裝置，給檢測單位和企業(yè)帶來麻煩。本研究依據現行的多拉菌素注射液標準，對含量測定中適用的固相萃取柱進行考察試驗，完善了多拉菌素注射液含量測定標準[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀；Waters Alliance E2695型高效液相色譜儀；色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；電子天平(型號 BT125D)購自德國賽托里斯公司。

1.2 試藥與試劑 多拉菌素對照品(批號為K0461411，標識含量為95.6%)來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；多拉菌素注射液(批號：1812002 規(guī)格：50 mL：0.5 g)來源于山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司；多拉菌素注射液(批號：1812001 規(guī)格：100 mL：1 g)來源于齊魯動物保健品有限公司；多拉菌素注射液(批號：PS185-1902001規(guī)格：50 mL：0.5 g)來源于艾美科健(中國)生物醫(yī)藥有限公司；多拉菌素注射液(批號：D801SICN 規(guī)格：50 mL：0.5 g)來源于施維雅(青島)生物制藥有限公司。固相萃取小柱SupelcleanTM LC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes購自美國Supelco公司；固相萃取小柱Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges購自美國Waters公司；甲醇為色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 流動相：甲醇-乙腈-水(67：15：18)；流速：1.0 mL/min；檢測波長245 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取多拉菌素對照品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇70 mL溶解，加水5 mL，混勻，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取1812002批樣品(50 mL∶0.5 g)1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，精密量取2.5 mL，過LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5 mL洗脫，洗脫液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 空白溶液的制備 精密量取輔料溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL定容。精密量取2.5 mL，過LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5 mL洗脫，洗脫液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗 精密量取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件測定，理論塔板數結果為6454，供試品溶液色譜圖中多拉菌素峰與對照品溶液色譜保留時間一致(圖1)。結果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測要求，供試品中其他成分對多拉菌素定量檢測無干擾，專屬性能滿足檢測要求。

圖1 專屬性試驗色譜圖(A、B、C分別為多拉菌素對照品、 魯抗舍里樂藥業(yè)多拉菌素注射液供試品、 魯抗舍里樂藥業(yè)多拉菌素注射液輔料)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test

2.4 線性關系考察 取多拉菌素對照品貯備液(濃度約1 mg/mL)，分別精密吸取適量，配制濃度約0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的系列溶液，按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，以進樣濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得回歸方程y= 4E+07x+ 56549(R2=1)，結果表明進樣濃度在0.01～0.8 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 準確度 采用加標回收的方法，在空白輔料溶液中，按工藝加入一定質量的多拉菌素對照品，分別配制80%、100%、120%濃度的多拉菌素注射液，分別制備3份。按2.1項色譜條件測定峰面積，計算平均回收率及RSD(表1)。結果表明：在三個濃度水平下，多拉菌素注射液回收率為100.2%，符合注射液回收率98%～101%的范圍要求，證實了該方法具有良好的準確度。

表1 回收率試驗結果Tab 1 Result of recovery test

2.6 精密度

2.6.1 儀器精密度 取2.2.1項對照品溶液，精密量取20 μL，按2.1項色譜條件重復進樣6次，測得多拉菌素峰面積RSD為0.2%，表明儀器有良好的精密度。結果見表2。

表2 儀器精密度試驗Tab 2 Result of instrument precision test

2.6.2 重復性 取供試品(批號為1812002)注射液，按2.2.2項方法配制6份樣品溶液，按2.1項色譜條件，每份樣品進樣2次，結果含量平均值為104.6%，RSD為0.9%。結果見表3。

表3 重復性試驗Tab 3 Result of repeatability test

2.6.3 中間精密度 取供試品(批號為1812002)注射液，換由另一位操作者按2.2.2項方法配制6份樣品溶液，選用Waters Alliance E2695液相色譜儀，Waters X-bridge C18色譜柱按2.1項色譜條件，每份樣品進樣2次，結果含量平均值為103.8%，RSD為0.6%。結果見表4。

表4 中間精密度試驗Tab 4 Result of intermediate precision test

2.7 耐用性

2.7.1 不同品牌固相萃取小柱耐用性試驗 取供試品溶液按照2.2.2項方法考察市面上在售的兩款固相萃取小柱：①SupelcleanTMLC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes；②Waters Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges。測定結果詳見表5。由表5可見，兩個廠家的固相萃取柱對含量測定的結果差異不顯著。市售的這兩款固相萃取柱均能滿足實驗要求。

表5 不同固相萃取柱測定多拉菌素含量Tab 5 Determination of Doramectin content by different SPE columns

2.7.2 方法耐用性試驗 取1812002批樣品(50 mL∶0.5 g)，按2.2項下方法制成供試品溶液，將色譜條件微小變動進行測試，考察方法的耐用性。結果表明該方法能夠耐受不同色譜柱、柱溫、流速等因素的小范圍變化，測得多拉菌素注射液中多拉菌素的含量無明顯差異，說明耐用性良好，結果見表6。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號為1812002)的樣品，按2.2項下方法制成供試品溶液，立即測定，再在2、4、8、12、16、20、24 h的時間點進行測定，所測峰面積均與0 h比較，12 h內相對偏差小于1%，提示樣品應在12 h內完成檢測。結果詳見表7。

表6 色譜條件微小變動后的結果Tab 6 Results of minor changes in chromatographic conditions

表7 穩(wěn)定性試驗Tab 7 Stability test

2.9 樣品含量測定 取不同廠家的樣品，按2.2項下方法制成供試品溶液，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，上機測定峰面積，通過外標法計算多拉菌素的含量，多拉菌素均在標示量的90.0%～110%。結果見表8。

表8 不同廠家樣品測定結果Tab 8 Results of samples from different manufacturers

3 討論與結論

3.1 色譜條件的選擇與確定 研究過程中對樣品的溶劑及色譜條件中流動相、檢測波長、柱溫、流速進行了嚴格的選擇性考察。研究表明，甲醇-乙腈-水(67：15：18)作為流動相，1.0 mL/min的流速在245 nm波長下色譜峰分離效果好，峰形較好[4-6]。

3.2 樣品前處理方法的選擇 多拉菌素注射液性狀為無色或微黃色澄明油狀液體，是一類抗寄生蟲藥[7-9]。參考2017版《獸藥質量標準》化學品卷多拉菌素注射液含量測定項下前處理方法，本研究采用固相萃取小柱進行樣品的前處理，降低了樣品的基質背景，凈化和富集了目標化合物，提高了樣品分析結果的可靠性和靈敏度[10-11]。結果證明該方法能夠較為完全地提取出多拉菌素注射液中的多拉菌素，并且方法的準確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達到檢測的要求[12-13]。

3.3 固相萃取小柱的選擇與啟示 固相萃取技術與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，可提高藥物回收率，能更加有效的將藥物與干擾組分分離。商品化的固相萃取小柱(SPE柱)能夠實現多樣品的平行處理，大大提高檢測的靈敏度。當液體樣品溶液通過固相吸附層時，被測物被富集，再選用適當強度溶劑沖去雜質，然后用少量溶劑迅速洗脫被測物質，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。需要注意的是：在選擇固相萃取柱時，要考慮固相吸附層的吸附能力，避免實際操作時出現過載現象。SPE柱應用于多拉菌素注射液等油性獸藥產品時，能夠有效的將有效成分與雜質進行分離，并且重現性較高[14]。以往的研究中SPE柱多用于獸藥殘留的檢測，本試驗對于其他分離效果不理想的獸藥產品的檢測提供了新的思路。

用高效液相色譜法測定多拉菌素注射液中多拉菌素的含量時，采用固相萃取小柱進行前處理，方法簡便，準確，回收率高，可有效控制該制劑中多拉菌素的含量。