王淑芳，董 飛，王 剛，俞明正，徐劍宏，史建榮*

（江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京），江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014）

酚類是一類含有活躍酚羥基的植物次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸、黃酮和花色苷類，具有抗氧化[1]、抗癌、抗衰老[2]等生理作用。在禾谷類籽粒中，酚酸是主要的酚類物質(zhì)[1,3]，以游離和結(jié)合形式存在。酚酸主要有沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸和芥子酸等[4-5]。早期以福林-酚法研究谷物中的總酚類物質(zhì)含量[6]，隨著研究的不斷深入，黃酮、酚酸和花色苷類物質(zhì)被分別測定[7]。然而，酚酸在各種植物源食品中的存在形式不同，因此，適合的提取和測定方法對(duì)深入研究谷物籽粒中的酚類物質(zhì)具有重要意義。

目前，植物食品中酚酸含量的測定主要采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法。Chen Zhijie等[8]采用HPLC法定量了小麥苗中酚酸的含量，孫元琳等[9]用HPLC定量了黑麥麩皮中酚酸的含量。因酚酸結(jié)構(gòu)相似，色譜條件顯著影響酚酸組分的分離，故近年來有學(xué)者引入高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法定量酚酸[10-11]。通過質(zhì)譜定量離子的選擇，避免了因分離度不理想而影響準(zhǔn)確定量的問題。然而，質(zhì)譜鑒定和定量對(duì)樣品純度要求較高，在前期制樣過程中，需要進(jìn)行初步純化，盡量去除結(jié)構(gòu)近似的雜質(zhì)，有助于定量離子的選擇。因此，合適的提取和前期純化方法有助于HPLC-MS法準(zhǔn)確定量酚酸。常用的酚酸提取溶劑有甲醇、乙醇和丙酮[12]，在水果和蔬菜酚酸提取中，使用乙醇為提取溶劑的較多，而在谷物酚酸提取中，甲醇較為常用。李春玲[12]比較了甲醇、乙醇和丙酮對(duì)景天中酚酸提取率的影響，結(jié)果顯示甲醇對(duì)酚酸的提取能力更好。但是在提取以結(jié)合酚酸為主，且淀粉含量高的樣品中的酚酸時(shí)，需先用堿液水解。對(duì)于結(jié)合酚酸含量高的谷物樣品，研究堿使用濃度和提取液料比有利于充分提取酚酸。前期研究發(fā)現(xiàn)，用堿水解小麥籽粒樣品后，水解液呈凝膠狀，酚酸分散其中難以分離，用常規(guī)方法難以提取，因而需用有機(jī)溶劑萃取的方法才能有效提取酚酸[13-14]。乙酸乙酯是較為有效的萃取溶劑，但對(duì)于不同的樣品，溶劑萃取時(shí)間和次數(shù)需進(jìn)一步探討。

目前，江淮麥區(qū)小麥主栽品種主要有江蘇省農(nóng)科院育成的寧麥系列、煙農(nóng)19、以及淮麥系列，黃淮麥區(qū)主栽品種有河南的百農(nóng)207、新麥26，山東的濟(jì)麥22等，北方春麥區(qū)主栽品種有黑龍江的龍麥35和內(nèi)蒙古的永良4號(hào)。由于受基因型[15]、氣候條件[16]、土壤狀況[17]等自然條件的影響，我國不同產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的小麥品質(zhì)存在極大差異[18]。同時(shí)，同一產(chǎn)區(qū)不同小麥品種營養(yǎng)和功能品質(zhì)有顯著差異。因此，研究小麥主要產(chǎn)區(qū)主栽品種酚酸含量的差異具有重要的意義。

本研究采用NaOH溶液水解小麥籽粒后，用乙酸乙酯萃取的方法，探討水解及萃取條件對(duì)小麥籽粒酚酸提取量的影響，并優(yōu)化提取條件；然后用HPLC-MS方法定量我國小麥主要產(chǎn)區(qū)主栽品種酚酸含量的差異。為我國小麥品種選育、品質(zhì)區(qū)劃及小麥的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥品種為：江淮麥區(qū)：寧麥系列、淮麥系類、揚(yáng)麥系類等；黃淮麥區(qū)：百農(nóng)207、矮抗58、新麥26等；北方麥區(qū)：龍麥35、津強(qiáng)7號(hào)、永良4號(hào)等，均為2017年收獲，詳見表1。

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子酸（G7384-100G）、原兒茶酸（08992-50MG）、4-羥基苯甲酸（240141-100G）、香草酸（94770-10G）、咖啡酸（C0625-2G）、丁香酸（S6881-5G）、對(duì)香豆酸（C9008-1G）、阿魏酸（128708-5G）和芥子酸（D7927-1G） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸、NaOH、乙酸乙酯 上海安譜生物科技有限公司。

表1 不同產(chǎn)地和品種小麥采樣點(diǎn)Table 1 Wheat sampling points from different growing areas and varieties

1.2 儀器與設(shè)備

ZHSY-50WS型水浴往復(fù)恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；5810R型離心機(jī) Eppendorf公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；AB6500 HPLC-MS 美國AB SCIEX公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 NaOH濃度對(duì)酚酸提取量的影響

小麥籽粒經(jīng)挑選除雜后，打粉過0.425 mm篩。分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），液料比為15∶1（mL/g）；然后用1 倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min萃取2 次，每次15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.2 液料比對(duì)酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1 倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min萃取2 次，每次15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.3 乙酸乙酯萃取時(shí)間對(duì)酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比15∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min振蕩2 次，每次萃取時(shí)間分別為5、10、15、20 min，合并兩次萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.4 萃取次數(shù)對(duì)酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比為15∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1 倍體積的乙酸乙酯分別在30 ℃、150 r/min振蕩萃取1、2、3 次，每次萃取時(shí)間為15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后-20 ℃保存待測。

1.3.5 提取條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以NaOH濃度、液料比和乙酸乙酯萃取時(shí)間為因素，以酚酸提取量為響應(yīng)值做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，優(yōu)化出最適條件組合。

1.3.6 測定指標(biāo)及方法

1.3.6.1 酚酸提取

在Chen Zhijie等[13]的方法上改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取2.00 g完全通過0.425 mm孔篩的小麥樣品于250 mL三角瓶中，按照本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的體積質(zhì)量比和不同濃度的NaOH溶液水解樣品，水解結(jié)束后采用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)水解液pH值在1.5～2.0之間；然后取1 倍體積的乙酸乙酯與水解液充分混合萃取不同時(shí)間，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上層乙酸乙酯層，重復(fù)此操作0～2 次，合并所有乙酸乙酯層于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)捎?0 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.6.2 HPLC條件

分別取2 μL上述提取液采用HPLC-MS進(jìn)行分析：Agilent XDB-C18（3.5 μm×2.1 mm，150 mm）色譜柱，流速為0.5 mL/min，流動(dòng)相A溶液為含1%甲酸的水溶液，B溶劑為含1%甲酸的乙腈溶液；流動(dòng)相洗脫程序：0～5 min，流動(dòng)相A由90%～60%；流動(dòng)相B從10%～40%；5～12 min，流動(dòng)相A從60%～10%；流動(dòng)相B從40%～90%；12～15 min，流動(dòng)相A從10%～90%；流動(dòng)相B從90%～10%；柱溫40 ℃。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

表2 酚酸質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of phenolic acid

離子化模式為電噴霧電離負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測，離子源溫度500 ℃，駐留時(shí)間100 ms，霧化氣壓50 psi，輔助氣壓50 psi，噴霧電壓-4 500 V，碰撞室射出電壓6 V。質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

1.3.6.4 酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

建立9 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，9 種酚酸在小麥基質(zhì)中均線性良好，相關(guān)系數(shù)R2不低于0.99，見表3。

表3 酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限檢測結(jié)果Table 3 Standard curves, LODs and LOQs of phenolic acids

1.3.6.5 酚酸含量計(jì)算公式

試樣中酚酸含量按計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中酚酸含量/（mg/kg）；V為樣品最終定容體積/mL；m為稱樣量/g；c為儀器測得試樣溶液中酚酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置重復(fù)3～6 次（n≥3），以表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒酚酸提取條件單因素試驗(yàn)

由圖1A可以看出，用不同濃度的NaOH溶液水解顯著影響小麥籽粒中酚酸的提取量。隨著NaOH濃度的不斷增加，酚酸提取量不斷上升，在1.5 mol/L時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)NaOH濃度為3.0 mol/L時(shí)，酚酸含量降低。NaOH作為強(qiáng)堿，能水解小麥籽粒中酚酸與大分子之間的共價(jià)結(jié)合鍵[9,19]，隨著濃度的增加，水解能力增強(qiáng)，但是濃度過高時(shí)，可能對(duì)酚酸內(nèi)部化學(xué)鍵具有破壞作用，導(dǎo)致酚酸降解。提取液料比能顯著影響酚酸提取率，隨著液料比的增大，酚酸提取量增加，在液料比為15∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到1 047.3 mg/kg（圖1B）。物質(zhì)在特定溶劑中的溶解度是一定的，隨著液料比的增加，溶解量不斷增加，但是液料比達(dá)到一定值后，酚酸幾乎被全部水解溶出，提取率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，本研究中液料比20∶1（mL/g）時(shí)不再增加酚酸提取量。在以結(jié)合酚為主的樣品中，結(jié)合酚酸被水解后需乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取才能獲得較純的提取物以便用HPLC-MS檢測[13,20]。本研究結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取時(shí)間對(duì)小麥籽粒酚酸提取量有顯著影響（圖1C）。當(dāng)提取時(shí)間大于15 min時(shí)萃取量達(dá)到最大，相比10 min萃取量增加45.02%。在設(shè)定乙酸乙酯為1 倍體積添加量和萃取15 min的情況下，萃取2 次以上對(duì)酚酸提取量無顯著影響（圖1D），因此后續(xù)采用萃取次數(shù)2 次，進(jìn)行NaOH濃度、液料比和乙酸乙酯萃取時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 NaOH濃度（A）、液料比（B）、萃取時(shí)間（C）和萃取次數(shù)（D）對(duì)酚酸提取量的影響Fig. 1 Effect of NaOH concentration (A), liquid-to-material ratio (B),extraction time (C) and number of extraction cycles (D) on the extraction efficiency of phenolic acid

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)小麥籽粒中酚酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。運(yùn)用Design Expert軟件，對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行Forward模式多元二次回歸擬合，得到小麥籽粒中酚酸提取量預(yù)測值的二次多項(xiàng)回歸方程：

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental and predicted values of phenolic acid

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analyses of variance for the effect of extraction conditions on the the extraction efficiency of phenolic acid

液料比和乙酸乙酯萃取時(shí)間之間有顯著的交互作用（P＜0.05），由圖2可知，當(dāng)液料比為10∶1（mL/g）時(shí)，萃取時(shí)間延長酚酸提取量先緩慢升高后有所降低；當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，隨著萃取時(shí)間的延長酚酸提取先迅速增加后緩慢下降，且液料比越大，酚酸提取量升高的速率越快。

圖2 液料比和乙酸乙酯萃取時(shí)間交互作用對(duì)酚酸提取量的影響Fig. 2 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-tosolid ratio and extract time on the extraction efficiency of phenolic acid

由回歸方程可得，NaOH水解-乙酸乙酯萃取方法提取小麥籽粒酚酸的最佳條件為NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.53∶1（mL/g）、萃取時(shí)間17.33 min、萃取2 次；模型預(yù)測值為1 053 mg/kg。便于操作，選取NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.5∶1（mL/g）、萃取時(shí)間17 min，在此提取條件下，小麥籽粒中酚酸提取量達(dá)到1 055.99 mg/kg，且顯著高于隨機(jī)組合試驗(yàn)結(jié)果（表6）；說明本試驗(yàn)所擬合的二次多項(xiàng)式模型可預(yù)測提取條件和提取量之間的關(guān)系。

表6 響應(yīng)面驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 6 Verification of optimal combination of extraction conditions

2.3 不同產(chǎn)區(qū)和品種小麥中主要酚酸組成和含量

由表7可以看出，小麥中的主要酚酸為阿魏酸，占總酚酸的73.07%～89.01%，其次為芥子酸。沒食子酸只有在江淮麥區(qū)的保麥6號(hào)中含有，其他地區(qū)的小麥中都不含有。咖啡酸主要存在于江淮麥區(qū)和北方麥區(qū)的小麥中。研究表明[21]，不同種類谷物間酚類物質(zhì)含量差異較大，同種類谷物不同品種間酚類物質(zhì)含量差異也較大。江淮麥區(qū)寧麥14中總酚酸含量最高，達(dá)1 001.12 mg/kg，和該產(chǎn)區(qū)的煙農(nóng)19、淮麥33有顯著性差異；黃淮麥區(qū)的品種新麥26中總酚酸含量最高，為1 016.03 mg/kg，和該產(chǎn)區(qū)的濟(jì)麥22、百農(nóng)207有顯著性差異。Curvas等[22]比較了6 種小麥總酚含量，變幅為133.25～173.48 mg/kg。由此可見，谷物酚類物質(zhì)含量主要受其種類和品種決定[23-24]。生長環(huán)境或產(chǎn)地的不同也會(huì)造成谷物多酚含量的較大差異。不同種類谷物的酚酸組成及含量差異也較大。Lin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，美國6 種小麥中，阿魏酸、對(duì)香豆酸、丁香酸、香草酸、咖啡酸等5 種酚酸平均含量變異系數(shù)分別為19.10%、18.54%、24.42%、21.83%和32.38%。此外，提取或制備方法也對(duì)谷物酚酸構(gòu)成及含量造成較大差異[26-27]。在本研究中，小麥采自中國江淮、黃淮和北方主要的小麥產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)自海拔低的小麥品種寧麥14、揚(yáng)麥16、揚(yáng)輻麥4號(hào)，產(chǎn)自高海拔的小麥品種龍麥35、津強(qiáng)7號(hào)永良4號(hào)中咖啡酸含量較高，暗示咖啡酸可能與抵御極端環(huán)境有關(guān)[28]。北方小麥中原兒茶酸和丁香酸含量高于江淮和黃淮產(chǎn)區(qū)小麥，而阿魏酸的含量相對(duì)較低。說明日照時(shí)間長和晝夜溫差大有助于原兒茶酸和丁香酸的累積[29]。

表7 不同產(chǎn)區(qū)和品種小麥中主要酚酸組成和含量Table 7 Main phenolic acid compositions and contents of different wheat varieties grown in different areas mg/kg

3 結(jié) 論

本研究經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化獲得NaOH水解-乙酸乙酯萃取一步法提取小麥籽粒中酚酸的條件為：NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.53∶1（mL/g）、萃取時(shí)間17.33 min、萃取2 次。以便操作，選取NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.5∶1（mL/g）、萃取時(shí)間17 min。在此提取條件下，小麥籽粒中酚酸提取量達(dá)到1 055.99 mg/kg。黃淮麥區(qū)的新麥26中總酚酸含量最高；阿魏酸為小麥中的主要酚酸，占總酚酸的73.07%～89.10%。不同產(chǎn)區(qū)小麥中酚酸的組成和含量差異較大，北方小麥中原兒茶酸、丁香酸和咖啡酸容易積累，而阿魏酸含量較江淮、黃淮區(qū)小麥低。本研究結(jié)果為我國主要產(chǎn)區(qū)小麥功能品質(zhì)提供了重要參考。