田會麗，孟 云，趙 森，糜唯鈺，姬 華，王周平,,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

銀在自然界中分布廣泛，主要應(yīng)用于電氣工業(yè)、攝影和成像工業(yè)以及制藥工業(yè)[1]。關(guān)于銀與必需營養(yǎng)素（尤其是硒、銅和VE和VB12）相互作用的研究越來越多，人們開始關(guān)注其潛在的毒性。美國環(huán)境保護局規(guī)定，水中的Ag＋濃度不應(yīng)超過0.9 μmol/L。相比其他形式的銀，Ag＋毒性最大[2]。因此，高靈敏和選擇性方法的發(fā)展檢測水介質(zhì)中痕量的Ag＋對環(huán)境和人類健康具有相當重要的意義。目前，Ag＋的檢測方法很多，如原子吸收光譜法[3]、催化動力學光度法[4]、電感耦合等離子質(zhì)譜法[5]等。雖然這些方法具有高選擇性和靈敏度，但也存在預(yù)處理復(fù)雜、耗時長、成本高等缺點，不利于實際應(yīng)用。因此，傳統(tǒng)的熒光探針已經(jīng)不適用于檢測水中的銀離子，開發(fā)一種快速、簡單、靈敏的銀離子檢測方法是非常重要的。

適配體由于親和性高和易于修飾等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于重金屬的檢測。DNA金屬堿基對因其在傳感應(yīng)用中的潛力而備受關(guān)注。一些金屬離子可以選擇性地與DNA雙鏈體中的一些天然或人工堿基結(jié)合，形成金屬介導的堿基對[6]。這通常會導致DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性增加。特別是，DNA-金屬堿基對通常用于促進單鏈或雙鏈寡核苷酸的結(jié)構(gòu)變化，例如，DNA雙鏈體中的C—C對能夠?qū)ｉT捕獲Ag＋以形成C—Ag＋—C結(jié)構(gòu)，形成一個穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而提高DNA鏈的解鏈溫度[7-11]。周學輝等[12]利用C—Ag＋—C錯配釋放出富含G堿基的序列從而形成G-四聚體，建立了Ag＋的傳感比色檢測方法，該方法的檢測限可達6.3 nmol/L，具有操作簡便、無需修飾等優(yōu)點。

黑磷是一種新型的二維層狀晶體。黑磷的直接帶隙結(jié)構(gòu)[13]和帶隙穩(wěn)定性使其廣泛應(yīng)用于光電領(lǐng)域，幾乎覆蓋了整個電磁波譜范圍[13-15]。基于黑磷與氧化石墨烯性質(zhì)相似，黑磷在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用也得以迅速發(fā)展，包括藥物輸送、氣體檢測、疾病治療和生物醫(yī)學成像等領(lǐng)域。黑磷因具有良好的消光系數(shù)、熱轉(zhuǎn)換效率特性、良好的生物降解性和生物低毒性等優(yōu)點，在光動力治療、藥物負載、熱處理和光成像等方面也有很大的優(yōu)勢[16-19]。

聚集誘導熒光淬滅（aggregation-caused quenching，ACQ）現(xiàn)象很容易發(fā)生在傳統(tǒng)有機熒光探針中，導致這種現(xiàn)象的主要因素是高濃度的熒光探針容易在聚集態(tài)發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，影響探針靈敏度，這是使用熒光信號檢測技術(shù)所極力避免的現(xiàn)象[20-23]。而9,10-二苯乙烯基蒽季銨鹽（9,10-distyryl sulfonium quaternary ammonium salt，DSAI）生物熒光探針與其他傳統(tǒng)的熒光分子相比，其最大的優(yōu)勢在于它在高濃度或聚集狀態(tài)下不會發(fā)生ACQ現(xiàn)象，且操作簡便、耗時短[24]。聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象因其獨特的性質(zhì)及其在生物、醫(yī)學領(lǐng)域以及食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用得到越來越多的科研工作者的關(guān)注。基于此，本研究旨在將聚集誘導發(fā)光材料與適配體識別技術(shù)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合并應(yīng)用于食品安全檢測中，通過將具有聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象的分子與這些新型、便捷的分析技術(shù)結(jié)合起來以建立更高效、更靈敏、更準確的新型檢測方法。聚集誘導發(fā)光技術(shù)的利用將會為食品安全檢測方法提供一個新的平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有的試劑和材料均為商業(yè)材料且不需純化即可使用。Ag＋適配體（CCTCCCTCCCTCCCTTTTTCCCA CCCACCCACC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；醋酸（HAc）、N,N-二甲基甲酰胺（均為分析純），三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，生物試劑） 國藥集團化學試劑有限公司；AgNO3、HNO3等試劑均為分析純；實驗用水均為Milli水系統(tǒng)處理的去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外-可見光吸收光譜 日本Shimadzu公司；F-7000發(fā)光分光光度計 日本日立公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本Jeol公司；Dimension ICON原子力顯微鏡 德國布魯克科技有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Starter 3C pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；Direct-Q3超純水制備儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 BPNS的制備及結(jié)構(gòu)表征

黑磷納米片（black phosphorus nanosheet，BPNS）制備：黑磷粉末中加入超純水，超聲波分散機超聲4 h，功率為300 W，然后將溶液于4 ℃、6 000 r/min離心30 min，取上清液備用。使用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡分別對BPNS的結(jié)構(gòu)尺寸進行表征。

1.3.2 適配體濃度優(yōu)化

適配體濃度直接影響反應(yīng)液的熒光強度以及實驗的最低檢測限，所以要對適配體濃度進行優(yōu)化。在EP管中加入不同濃度的適配體儲備溶液（0、1、5、8、10、50、80、100 nmol/L）并與5 μL DSAI混合，然后加入Tris-HAc緩沖液（20 mmol/L、pH 7.0）確保反應(yīng)總體系為500 μL，室溫下測定熒光發(fā)射光譜。

1.3.3 BPNS濃度優(yōu)化

BPNS作為熒光淬滅材料，其濃度會影響該傳感系統(tǒng)的靈敏度。將優(yōu)化好的適配體儲備溶液與EP管中的5 μL DSAI混合，然后加入一系列不同濃度的BPNS上清液，然后將緩沖液加入到EP管中以確保反應(yīng)總體系為500 μL，并且在室溫下測定熒光光譜確定最佳濃度。

1.3.4 靈敏性和選擇性測定

在最優(yōu)條件下，將不同質(zhì)量濃度的靶標Ag＋（0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500 ng/mL）依次加入EP管中，加入Tris-HAc緩沖液（20 mmol/L、pH 7.0），保證反應(yīng)總體系為500 μL，室溫下測定熒光光譜。

為了評估該實驗用于高度特異性檢測Ag＋的能力，選擇7 種不同的金屬離子（Fe3＋、K＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、Pb2＋和Cu2＋）分別進行測試，所有的金屬離子都以相同的濃度進行實驗。所有其他檢測條件與Ag＋檢測中使用的條件相同。

1.3.5 純凈水中Ag＋加標回收測定

為了證明這種方法的可行性，選擇純凈水作為加標回收實驗的樣品。將3 種不同質(zhì)量濃度的Ag＋（1、10 ng/mL和50 ng/mL）加入水樣品中以獲得試驗樣品。將不同質(zhì)量濃度的Ag＋溶液分別與50 μL 120 nmol/L的適配體和60 μL/100 μL的BPNS進行混合，加入Tris-HAc緩沖液（20 mmol/L、pH 7.0）確保反應(yīng)總體系為500 μL，孵育40 min。然后10 000 r/min離心10 min。最后將5 μL DSAI加入反應(yīng)體系中，孵育30 min后室溫測定熒光發(fā)射光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

靈敏性和選擇性實驗和加標回收實驗的所有數(shù)據(jù)均測量3 次。本實驗的所有數(shù)據(jù)采用Origin pro 9.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPNS的制備及其結(jié)構(gòu)表征

圖1 用于檢測Ag＋的適配體傳感器示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the aptasensor for detection of Ag＋

如圖1所示，選取一段富含胞嘧啶的Ag＋核酸適配體，首先在Ag＋存在下，適配體與靶標作用生成C—Ag＋—C結(jié)構(gòu)，從而使核酸適配體的構(gòu)象從無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閁型結(jié)構(gòu)[25-26]。這種結(jié)構(gòu)一般情況下比較穩(wěn)定，不會被破壞。由于適配體的U型結(jié)構(gòu)，當加入BPNS后適配體不會被BPNS吸附。DSAI分子是帶有正電的水溶性熒光探針，可以通過靜電吸附作用以及疏水相互作用與核酸適配體進行結(jié)合[27]，因此溶液體系熒光增強，當適配體與Ag＋之間形成穩(wěn)定的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)后，DSAI分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限，能量以非輻射耗散的形式釋放，因此，溶液體系的熒光進一步增強，從而產(chǎn)生聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象。反之，若溶液中為其他金屬離子時，適配體的構(gòu)象不會發(fā)生改變，仍然保持無規(guī)則結(jié)構(gòu)。加入BPNS后，BPNS通過靜電吸附作用使適配體吸附在BPNS表面。DSAI通過靜電吸附作用和疏水作用纏繞在適配體上，同時，DSAI的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用被BPNS淬滅，溶液不發(fā)光。所以通過觀察DSAI熒光強度的變化，即可以檢測溶液中的Ag＋。

BPNS獨特的物理化學性質(zhì)取決于它的形狀和厚度。利用液相剝離法，通過多次超聲和離心清洗制備納米尺寸的BPNS。BPNS的透射電子顯微鏡圖像（圖2A）顯示，其結(jié)構(gòu)近似為片狀，表明BPNS制備成功。通過原子力顯微鏡進一步表征制備的BPNS的厚度。圖2B～D為BPNS的原子力顯微鏡圖像，通過計算得出所制備的BPNS的平均厚度約為15 nm（圖2D）。

圖2 BPNS的透射電子顯微鏡（A）和原子力顯微鏡（B～D）圖像Fig. 2 Transmission electron microscope (A) and atomic force microscope (B-D) images of BPNS

2.2 適配體濃度優(yōu)化

在該傳感系統(tǒng)中使用的適配體濃度直接影響反應(yīng)液的熒光強度以及實驗的最低檢測限，所以要對適配體的濃度進行優(yōu)化。如圖3所示，隨著適配體濃度的增加，反應(yīng)液的熒光強度逐漸增強。然而，當適配體濃度達到80 nmol/L后熒光強度基本保持恒定。因此選擇適配體的濃度為80 nmol/L進行后續(xù)實驗。

圖3 DSAI在不同濃度的適配體中的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of aptamers

2.3 BPNS添加量的優(yōu)化

BPNS作為熒光淬滅材料，濃度大小會直接影響實驗結(jié)果的準確性以及靈敏度。因此，在確定適配體的濃度為80 nmol/L后，依次加入不同濃度的BPNS上清液并確定其最佳添加量。如圖4所示，隨著BPNS上清液添加量的增加，DSAI的熒光強度逐漸降低，表明DSAI的熒光被BPNS淬滅的程度越來越高。因為高濃度的BPNS會對熒光產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)以及為了提高實驗結(jié)果的靈敏度以及準確性，最終選擇60 μL/100 μL作為BPNS的最佳添加量。

圖4 DSAI在不同添加量的BPNS中的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of BPNS

2.4 熒光適體傳感器的分析性能

為研究該熒光適體傳感器的靈敏度，在優(yōu)化的實驗條件下檢測0～500 ng/mL的Ag＋。如圖5所示，溶液的熒光強度恢復(fù)并增強，表明隨著Ag＋濃度的增加，DSAI/適配體/Ag＋與BPNS之間的相互吸附作用減弱，使得DSAI/適配體/Ag＋遠離BPNS并且避免了DSAI的熒光被BPNS淬滅，使得溶液熒光恢復(fù)并增強。說明靶標Ag＋可以被特異性識別。該熒光適體傳感器的熒光強度（Y）與Ag＋質(zhì)量濃度的對數(shù)（X）呈正相關(guān)，且在Ag＋質(zhì)量濃度為0.01～100 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為Y=22.52X＋675.12，R2=0.991 2，檢測限為0.002 ng/mL。

圖5 不同質(zhì)量濃度Ag＋時DSAI的熒光光譜Fig. 5 Fluorescence spectra of DSAI with different concentrations of Ag＋

圖6 其他金屬離子干擾性考察Fig. 6 Relative fluorescence intensity of the biosensor in the presence of other coexisting metal ions

為了評估該熒光適體傳感器對Ag＋的特異性，利用該熒光適體傳感器對其他重金屬離子進行干擾性實驗檢測。如圖6所示，Ag＋適配體對鉀離子和鎂離子有一定的親和性，但由于Ag＋適配體對鉀離子和鎂離子產(chǎn)生的熒光強度低于對銀離子的熒光強度的20%，并且含有Ag＋溶液的熒光強度比檢測系統(tǒng)中的其他干擾物具有更明顯的信號，說明該方法具有良好的選擇性，其他干擾物可能不會影響檢測系統(tǒng)。這是由于適配體能與靶標Ag＋特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導致適配體的構(gòu)象發(fā)生改變，且DSAI從BPNS上釋放并聚集吸附在發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，因此使得溶液的熒光能夠恢復(fù)和增強。結(jié)果表明，所構(gòu)建的生物傳感器對Ag＋具有良好的特異性。

目前報道的關(guān)于銀離子檢測的文獻，如Sun Jian等[28]研究組報道了一種具有超靈敏檢測銀離子的納米材料AuNCs，但這種材料在低濃度下具有較高的毒性；Anand等[29]開發(fā)了一種熒光探針Cysan，但這種探針的水溶性差，限制了其在實際中的應(yīng)用；Yang Yue等[30]利用二萘嵌苯熒光探針結(jié)合適配體檢測水中的銀離子，探針在水溶液中會發(fā)射熒光，影響探針的靈敏度，使檢測限上升。Ono等[31]開發(fā)了一個由熒光標記的寡核苷酸探針和淬滅劑，在核酸適配體的一端修飾熒光基團，另一端修飾熒光淬滅基團，它對Ag＋檢測靈敏且選擇性高，但這種探針價格昂貴，不利于實際應(yīng)用。與丁靜等[32]開發(fā)的利用單壁碳納米管猝滅效檢測Ag＋相比，本實驗具有較低的檢測限。除此之外，本實驗無需進行FAM標記，從而降低了實驗成本。

2.5 純凈水中Ag＋加標回收測定

為了評估該傳感系統(tǒng)在實際應(yīng)用中的可行性和可靠性，通過標準加入法確定3 種不同Ag＋濃度的回收率。將樣品摻入不同Ag＋量的水樣中。在該實驗中每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次。如表1所示，回收率在94.9%～105.82%之間。結(jié)果證明該傳感器方法可用于分析實際樣品。

表1 適配體測定法檢測純凈水樣品中Ag＋的回收率Table 1 Recovery rates of Ag+ by aptamer assay in puri fied water samples

3 結(jié) 論

本實驗開發(fā)了一種超靈敏的生物傳感器，基于聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象的熒光探針和適配體識別技術(shù)檢測Ag＋。由于巧妙的設(shè)計，檢測限低至0.002 ng/mL，比世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的指導標準[33]允許的Ag＋限值低50 倍。與用于Ag＋分析的其他方法相比，該方法不需要對所需適配體進行額外修飾，具有簡單和低成本的優(yōu)點。聚集誘導發(fā)光分子DSAI與其他傳統(tǒng)的熒光分子相比，能很好地避免在高濃度或聚集狀態(tài)下不會發(fā)生ACQ現(xiàn)象，且操作簡便、穩(wěn)定性強、耗時短。然而，在這項工作中只檢測到一種分析物。因此，未來的工作應(yīng)該集中在多分析物的測定上，為豐富和提高食品安全檢測技術(shù)提供了新的思路。