唐鴻標(biāo)，陳楚欣，林俊芳,*，婁海偉，葉志偉，郭麗瓊,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），屬子囊菌門（Ascomycota）昆蟲寄生真菌[1]，在我國(guó)被廣泛用作民間醫(yī)藥或功能性食品[2]。蛹蟲草子實(shí)體的活性成分含量高，如蟲草多糖、總氨基酸、腺苷、蟲草素等，因此常被用作冬蟲夏草的替代品[3-4]。蛹蟲草具有多種藥理功能，如抗藥性、炎癥、抑制腫瘤和癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5]、增強(qiáng)動(dòng)物和人的免疫力[6]、抗衰老、抗氧化[7-8]、抗凝血、降血糖[9-10]等。

在傳統(tǒng)人工培養(yǎng)過程中，光照被用于刺激蛹蟲草原基的形成和子實(shí)體的分化[11-12]。在固體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)條件下，當(dāng)暴露于充足光照下，菌絲的顏色將從白色變?yōu)辄S色[13-14]。隨著光照培養(yǎng)的繼續(xù)進(jìn)行，蛹蟲草子實(shí)體繼續(xù)分化，蟲草色素持續(xù)積累[15-16]。在光合作用植物、藻類和大型真菌的生長(zhǎng)過程中，各種色素在協(xié)調(diào)生物體的正常發(fā)育和生長(zhǎng)方面發(fā)揮著各種作用[17]。如葉綠素吸收光能并將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量[18]；類胡蘿卜素淬滅由光產(chǎn)生的氧自由基并保護(hù)細(xì)胞組織[19-20]。因此，為了研究蛹蟲草黃色素在蛹蟲草發(fā)育過程中的重要作用，必須先對(duì)蛹蟲草黃色素的種類進(jìn)行鑒定及歸類。

付鳴佳[21]在蛹蟲草中發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素。有研究在蛹蟲草中發(fā)現(xiàn)了玉米黃素[22]和葉黃素[23]，并成功鑒定出4 種新型的水溶性北蟲草黃素[24]。除了蛹蟲草黃色素，多種蟲草屬真菌也都各具有色素。在雙棱孢蟲草（Cordyceps bifusispora）中發(fā)現(xiàn)一種新型黃色素[25]，從冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）的發(fā)酵液中分離出黑色素[26]，單側(cè)蟲草（Cordyceps unilateralis BCC 1869）中發(fā)現(xiàn)了萘醌[27]。

本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)蛹蟲草黃色素進(jìn)行分離純化，并結(jié)合質(zhì)譜法、紫外-可見光譜法、傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜法對(duì)純化素色進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)，采用響應(yīng)面法對(duì)蛹蟲草黃色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為其日后的生產(chǎn)和綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草（C. militaris CM 19）保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物煉制實(shí)驗(yàn)室；CM 19子實(shí)體購(gòu)買自廣東省江門市鴻豪生物科技有限公司。

甲酸、乙腈均為色譜純，其他提取用有機(jī)溶劑均為分析純，購(gòu)自成碩化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

An UV2310II紫外分光光度計(jì) 中國(guó)杭州奧盛儀器有限公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司；FD-1D-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Synapt G2-Si液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；LC-2030 HPLC儀 日本島津公司；Vertex 70 FTIR光譜儀德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草新型黃色素種類鑒定

1.3.1.1 提取溶劑的確定

蛹蟲草子實(shí)體經(jīng)冷凍干燥、粉碎、過60 目篩備用。取子實(shí)體粉末1.0 g，加入20.0 mL不同溶劑（丙酮、乙醚、石油醚、水、甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇），充分振蕩2 min，室溫浸提30 min，8 000×g離心10 min，取上清液觀察。

1.3.1.2 黃色素提取液的分離純化

樣品的制備：取1.3.1.1節(jié)中50%乙醇提取液，過0.22 μm微孔濾膜后，供HPLC分析。

HPLC檢測(cè)條件：GL Inertsil C18ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。洗脫程序?yàn)椋篈相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈溶液（0 min， 45% B；1 min，45% B；8 min，48% B；9 min，45% B；14.21 min，停止）。采用二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD），檢測(cè)波長(zhǎng)為449 nm。在此基礎(chǔ)上，利用制備型HPLC對(duì)各峰進(jìn)行收集。

1.3.1.3 純化色素的HRMS與FTIR分析

高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）檢測(cè)條件：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)200～800 nm，干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速750 L/h；毛細(xì)管電壓2.5 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000。

FTIR檢測(cè)條件：采用溴化鉀壓片法，按照1∶100的比例加入純化黃色素樣品和溴化鉀，研磨均勻后壓片，在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定紅外光譜。

1.3.2 純化黃色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及提取量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取5.0 mg純化色素，加入1.0 mL二甲基亞砜，充分溶解后過0.22 μm微孔濾膜，再用色譜純乙腈稀釋成不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL），以1.3.1.2節(jié)方法進(jìn)行HPLC分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=80 411X-3 830.9，R2=0.999 4。Y為純化色素峰積分面積，X為純化色素質(zhì)量濃度（μg/mL）。蛹蟲草純化色素提取量按下式計(jì)算：

式中：m0為用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定得到的純化色素質(zhì)量/μg；M0為蛹蟲草子實(shí)體質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別以甲醇、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)（0%、20%、40%、60%、80%、100%）、提取溫度（4、16、25、40、50、60、70、80 ℃）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取時(shí)間（15、30、45、60、90、120、160 min）為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)純化色素提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以純化色素提取量為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間3 個(gè)因素，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以表示（n=6），采用Tukey’s Multiple Comparison Test進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的比較

圖1 不同提取溶劑的比較Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of yellow pigment with different solvents

如圖1所示，蛹蟲草黃色素能較好地溶解于水（圖1H）、甲醇（圖1E）溶劑，以及水分別與甲醇、乙醇的混合液（圖1G、1F）。其微溶于乙醇（圖1D）、丙酮（圖1C）溶劑，在乙醚（圖1B）、石油醚（圖1A）中溶解性極差，說明水等強(qiáng)極性溶劑的提取效果明顯優(yōu)于石油醚等弱極性有機(jī)溶劑。根據(jù)相似相溶原理，說明蛹蟲草黃色素是一類極性較大的化合物[28]。

2.2 HPLC、HRMS分析結(jié)果

為了進(jìn)一步了解從蛹蟲草中獲得的色素種類，采用HPLC分離純化蛹蟲草粗提物，結(jié)果顯示蛹蟲草黃色素有9 個(gè)主要峰（圖2A），各峰的分離度均大于1.5，說明通過反相C18柱可以實(shí)現(xiàn)蛹蟲草黃色素的有效分離。同時(shí)，對(duì)第5號(hào)峰（保留時(shí)間為5.562 min）進(jìn)行HRMS與全波長(zhǎng)掃描測(cè)試，結(jié)果表明，純化色素5準(zhǔn)分子離子峰為m/z262.108 6 [M-H]-（圖2B），并推測(cè)其分子式為C14H17N1O4。全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，純化色素5在278、449 nm和477 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)到最大吸收波長(zhǎng)（圖2C），表明該色素具有與類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)相似的不飽和共軛體系[29]。

圖2 HPLC、HRMS譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram and HRMS spectra

2.3 FTIR分析結(jié)果

圖3 純化色素5 FTIR光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of purified pigment 5

如圖3所示，純化色素5在3 384 cm-1處產(chǎn)生吸收，結(jié)合MS結(jié)果，氮規(guī)則表明該化合物有奇數(shù)個(gè)N原子存在，故推測(cè)此處為仲胺（R—N—H）伸縮振動(dòng)。樣品在3 303 cm-1處有強(qiáng)的寬帶（R—O—H伸縮）振動(dòng)吸收，并且在1 078、1 145 cm-1和1 175 cm-1處有較強(qiáng)的（C—O單鍵）振動(dòng)吸收，在1 695 cm-1和1 565 cm-1處產(chǎn)生強(qiáng)的（C＝C）伸縮振動(dòng)，在876 cm-1處產(chǎn)生（C—H）面外扭擺振動(dòng)吸收，表明純化色素5具有與類胡蘿卜素相似的紅外吸收特征[30]。同時(shí)，根據(jù)純化色素5具有不飽和共軛多烯結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將該色素命名為蟲草烯。

為了最終確定蟲草烯的分子結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)，需結(jié)合核磁共振波譜法和單晶衍射技術(shù)對(duì)蟲草烯進(jìn)一步分析。同時(shí)，鑒于蟲草烯具有與類胡蘿卜素相似的紫外、紅外吸收特征，蟲草烯在抗氧化、抗衰老方面的藥用價(jià)值也值得進(jìn)一步研究。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 甲醇、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲草烯提取量的影響

圖4 甲醇、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲草烯提取量的影響Fig. 4 Effects of methanol and ethanol concentration on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溫度25 ℃、料液比1∶20、提取時(shí)間30 min條件下，測(cè)定不同體積分?jǐn)?shù)甲醇和乙醇溶液對(duì)蟲草烯提取量的影響。由圖4可知，當(dāng)甲醇、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%，蟲草烯提取量最大，分別為（903.13±42.21）μg/g和（1 145.04±59.13）μg/g。再增加體積分?jǐn)?shù)時(shí)，由于子實(shí)體粉末中脂溶性物質(zhì)的溶出增加，從未減少蟲草烯的溶解，提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[31]。同時(shí)，由于甲醇具有一定毒性，不適宜應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)，所以選擇60%乙醇溶液作為最佳提取溶劑。

2.4.2 提取溫度對(duì)蟲草烯提取量的影響

圖5 提取溫度對(duì)蟲草烯提取量的影響Fig. 5 Effect of extraction temperatures on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、料液比1∶20、提取時(shí)間30 min條件下，測(cè)定不同提取溫度對(duì)蟲草烯提取量的影響。由圖5可知，在較低溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，增加了水分子的動(dòng)能，促進(jìn)了擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的進(jìn)

行[32]，蟲草烯提取量不斷增加，在40 ℃時(shí)提取量達(dá)到最大值（1 277.15±57.78） μg/g。超過40 ℃后，高溫破壞蟲草烯的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致蟲草烯碳鏈分解，失去原有的光學(xué)性質(zhì)，蟲草烯提取量呈現(xiàn)較快的下降。因此，在單因素優(yōu)化試驗(yàn)過程中，始終保持提取環(huán)節(jié)在40 ℃以下的工作環(huán)境中進(jìn)行。

2.4.3 料液比對(duì)蟲草烯提取量的影響

圖6 料液比對(duì)蟲草烯提取量的影響Fig. 6 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間30 min條件下，測(cè)定不同料液比對(duì)蟲草烯提取量的影響。由圖6可知，蟲草烯提取量隨料液比的增加，呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，提取量達(dá)到（1 489.71±50.01）μg/g。這一現(xiàn)象符合質(zhì)量傳遞原則，當(dāng)提取溶劑使用量比較大時(shí)，較大的濃度差會(huì)促使傳質(zhì)推動(dòng)力增加，使傳質(zhì)速率增大，從而提高提取量[33-34]。再增大料液比，提取量的增加不明顯，表明溶劑已將有效成分基本溶出完全。同時(shí)，過大的料液比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，不利于后期濃縮工作的進(jìn)行。因此，選擇1∶20作為最佳的料液比，繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)蟲草烯提取量的影響

圖7 提取時(shí)間對(duì)蟲草烯提取量的影響Fig. 7 Effect of extraction time on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、提取溫度40 ℃、料液比1∶20條件下，測(cè)定不同提取時(shí)間對(duì)蟲草烯提取量的影響。由圖7可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲草烯提取量不斷增加，當(dāng)時(shí)間超過45 min，提取量趨于降低。提取45 min時(shí)，提取溶劑中蟲草烯提取量趨向飽和狀態(tài)，提取量達(dá)到（1 915.95±65.98）μg/g，時(shí)間不再成為影響提取量的重要因素。但隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，40 ℃乙醇容易混發(fā)，減少的乙醇導(dǎo)致提取量緩慢降低[35-36]。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程擬合

利用Design-Expert V8.0.6軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，結(jié)果見表2。經(jīng)擬合回歸，得到綜合得率Y對(duì)自變量A、B、C的回歸方程Y=2 212.08-438.49A＋152.21B＋179.90C＋60.57AB-112.06AC＋5.91BC-967.37A2-248.90B2-317.68C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded values with response variable

2.5.2 響應(yīng)面模型方差及可行度分析

表3 回歸模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

由表3可知，此模型P值小于0.01，表明回歸模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)P=0.125 4＞0.05，模型失擬度不顯著，模型相關(guān)系數(shù)R2為0.983 3，校正決定系數(shù)R2Adj為0.961 8表明此模型擬合優(yōu)度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用該模型分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)蛹蟲草蟲草烯提取量的影響[37-38]。在一次項(xiàng)中，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)蛹蟲草蟲草烯提取量的影響極顯著；提取溫度對(duì)蟲草烯提取量的影響顯著。各因素顯著性程度依次為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度。

2.5.3 交互作用分析結(jié)果

圖8 各因素交互作用對(duì)蟲草烯提取量影響的響應(yīng)面圖Fig. 8 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on cordycepene extraction

由圖8可知，蟲草烯提取量隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，說明該模型具有極大值。響應(yīng)面的陡峭程度隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間的變化起伏較大，說明乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)蟲草烯提取量的影響大于提取溫度。以上分析與表3的方差分析結(jié)論一致。

2.5.4 工藝參數(shù)優(yōu)化驗(yàn)證結(jié)果

表4 提取次數(shù)對(duì)蟲草烯提取率的影響Table 4 Effect of number of extraction cycles on the extraction yield of cordycepene

通過軟件求解回歸方程，最佳蛹蟲草蟲草烯提取條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)57.68%、提取溫度44.40 ℃、提取時(shí)間52.44 min，預(yù)測(cè)蟲草烯提取量可達(dá)到2 299.61 μg/g。在此條件下，測(cè)定實(shí)際蛹蟲草黃色素得率為（2 259.23±83.88）μg/g（表4），與預(yù)測(cè)值相近，偏差較小，證明了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。同時(shí)，在最佳提取條件下，進(jìn)行多次提取，確定提取級(jí)數(shù)和蟲草烯在子實(shí)體粉末中的最終含量。蟲草烯提取量隨著提取次數(shù)的增加而增大，當(dāng)提取級(jí)數(shù)達(dá)到第7次時(shí)，HPLC已經(jīng)檢測(cè)不到蟲草烯的存在，此時(shí)蛹蟲草子實(shí)體中蟲草烯提取量為（2 780.97±170.38）μg/g（表4）。當(dāng)提取級(jí)數(shù)達(dá)到第3次時(shí)，蟲草烯提取率已達(dá)到99.88%（表4），為了節(jié)省提取時(shí)間和減少提取溶劑的使用，故確定提取級(jí)數(shù)為3 級(jí)[39-40]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC、質(zhì)譜與FTIR相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)一種新型的蛹蟲草黃色素，推測(cè)其分子結(jié)構(gòu)式為C14H17N1O4。該色素具有與類胡蘿卜素相似的紫外-可見光和紅外吸收特征，表明該色素具有不飽和共軛多烯結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，故將其命名為蟲草烯。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果顯示，各因素對(duì)蟲草烯提取量的顯著性程度依次為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度，確定蟲草烯最佳提取工藝條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)57.68%、提取溫度44.40 ℃、提取時(shí)間52.44 min，實(shí)際測(cè)定蟲草烯提取量為（2 259.23±83.88）μg/g。提取級(jí)數(shù)確定為3 級(jí)，此時(shí)蟲草烯提取率可達(dá)99.88%，含量為（2 777.72±170.46）μg/g（表4）。