王柳月 李慧美 馬夢琪 梁明星 賀如陽 陳華波

（湖北文理學院醫(yī)學院，襄陽 441053）

定點突變是研究基因功能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常用方法，目前主要使用PCR 介導的突變引入技術(shù)。PCR 即聚合酶鏈式反應，是一種在體外迅速擴增特定目標DNA 片段的分子生物學技術(shù)［1-2］。在此基礎上發(fā)展起來的重疊延伸PCR（Overlap extension PCR，OE-PCR）是基因定點突變的主要方法［3-5］。整個OE-PCR 需要4 條引物，兩輪共3 次PCR 反應，其繁瑣的流程一直為科研工作者所詬病［6-8］。近年來陸續(xù)發(fā)展出新的定點突變解決方案，主要有滾環(huán)擴增法與大引物PCR 法［9］，據(jù)稱能簡化流程，提高突變效率。也有研究者認為這兩種方法各有弊端，如滾環(huán)擴增法容易引入新的非預期突變［10］，而大引物PCR 法始終無法徹底避免對原始基因的擴增［11］。因此，大多數(shù)科研工作者仍傾向于使用OE-PCR 法制作定點突變，并不斷提出優(yōu)化方案以期提升工作效率。如有人提出平行模板法可以避免原始基因的擴增，于是可在同一個小管內(nèi)完成對基因突變體的擴增［12］。

結(jié)合實際工作經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)OE-PCR 定點突變時效率不穩(wěn)定，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化之后的克隆形成數(shù)較少，克隆陽性率偏低。另一個較為普遍的現(xiàn)象是當把基因從一個載體中酶切出來直接連入另一個載體時，轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較多，檢測陽性率較高（幾乎100%）。而克隆一個新基因或制作一個定點突變時，轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較少，檢測陽性率也往往不高。適當增加酶濃度，或延長酶切時間有助于增加克隆形成數(shù)和陽性率，但始終無法達到前者的效果。兩者的主要區(qū)別在于前者酶切PCR 產(chǎn)物時切點往往位于DNA 末端，而后者酶切質(zhì)粒時切點位于DNA 中間。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都不能作用于DNA 頂端序列，因此在設計引物時會在酶切位點外側(cè)增加1-3 個“保護堿基”，盡管如此其酶切效率往往只能達到最大值的20%-50%.據(jù)此推測靠近PCR 產(chǎn)物末端的低效限制性酶切是制約基因克隆和定點突變效率的主要原因。據(jù)此，我們提出旁側(cè)引物法以期改善定點突變效率。即將常規(guī)OE-PCR 上、下游引物匹配位點由基因兩端外延50-100 bp，適當增加第二輪PCR 產(chǎn)物的長度，使目標基因兩側(cè)的酶切位點遠離DNA 末端，從而提高隨后的酶切效率。

周期蛋白依賴性激酶4（Cyclin-dependent kinase 4，CDK4）是細胞周期的重要調(diào)節(jié)基因［13-14］，它與cyclin D1以復合物的形式共同調(diào)節(jié)細胞周期G1/S 轉(zhuǎn)換［15-16］。CDK4_D158N 是其重要的激酶活性缺失突變體，常用于CDK4功能研究［17］。以制作CDK4_D158N 為例，采用常規(guī)引物與旁側(cè)引物法并行OEPCR 操作，發(fā)現(xiàn)旁側(cè)引物法極大地提高了基因定點突變的克隆形成數(shù)與突變成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 感受態(tài)大腸桿菌Trans5α Chemically Competent Cell（CD201-01）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pEGFP_C2（Catalog#6083-1，Clontech），pcDNA3.1（Catalog no. V800-20，Invitrogen）及CDK4基因相關質(zhì)粒由北京大學生命科學學院張傳茂教授饋贈。

1.1.2 試 劑 2×PCR Reagent（KT207） 購 自 天根生化科技（北京）有限公司；PyrobestTMDNA Polymerase（R005A），DNA Ligation Kit Ver.2.1（6002）購自Takara 寶生物工程（大連）有限公司；內(nèi)切酶EcoR I（R0101V）、SalI（R0138V）購自NEB 紐英倫生物技術(shù)北京有限公司；DNA 快速回收/純化試劑盒（NEP013-2）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒（D0003）購自碧云天生物技術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 旁側(cè)引物序列參考Invitrogen 中國測序通用引物序列（http：//www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/china/common-vector-primer-list.pdf），其他引物采用Primer Premier 5. 0 軟件設計，相關引物序列見表1。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE 純化。

表1 引物信息表

1.2.2 PCR 擴增目標基因及陽性菌落檢測 擴增目標基因采用高保真PyrobestTMDNA Polymerase，第一輪PCR 方案：2 μL 10×buffer，1.2 μL dNTP，0.2 μL primer 1，0.2 μL primer 2，0.2 μL 酶，0.1 μL（10 ng）質(zhì)粒，補水至20 μL；第二輪PCR 方案：2 μL 10×buffer，2 μL dNTP，0.2 μL primer 1，0.2 μL primer 2，0.2 μL 酶，0.5 μL 上游片段回收物，0.5 μL下游片段回收物，補水至20 μL；運行程序皆為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，30 循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收至20 μL ddH2O 中。用PCR 法檢測陽性菌落時選用快速2×PCR Reagent，方案：5 μL 2×Taq，0.1 μL primer 1，0.1 μL primer 2，0.8 μL 細菌培養(yǎng)物，補水至10 μL；擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，30 循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.3 基因克隆與序列分析 取5 μL 含點突變的目的基因回收物，加2 μL 10×buffer，0.5 μLEcoRI，0.5 μL，SalI，補水至20 μL，37℃孵育一定時間；取pEGFP_C2 質(zhì)粒1 μg，采取上述同樣方式酶切1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O 中。用DNA Ligation Kit Ver.2.1 連接：載體0.5 μL，DNA片段4.5 μL，solution I 5 μL 混合，16℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，用卡那霉素固體培養(yǎng)基篩選，結(jié)合PCR 檢測陽性菌落。對相應PCR 產(chǎn)物回收或陽性菌落小量提取質(zhì)粒后進行序列測定，序列測定采用ABI3730 系列測序儀，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 平行模板法無法避免原始基因的擴增

平行模板法即選用兩個含同一目標基因的不同質(zhì)粒作為模板，在這兩個質(zhì)粒上分別選一段序列作為引物［18］，支持者認為“當兩種模板和兩條外側(cè)引物同時存在于一個反應管時，可以完全避免對野生型目的基因全長的擴增［12］，只有在突變引物存在的情況下才能擴增出產(chǎn)物，因此目標產(chǎn)物一定含有預期定點突變。為檢測上述理論，選用pEGFP_C2-CDK4與pcDNA3.1-CDK4兩種質(zhì)粒作為平行模板，選用pcDNA3.1 多克隆位點（Multiple cloning site，MCS）上游86 bp 處的T7 promoter（pEGFP_C2 中無對應序列）作為上游引物，選用pEGFP_C2 MCS 下游61 bp 處的pEGFP_C3′（pcDNA3.1 中無對應序列）作為下游引物。將兩種質(zhì)粒單獨作為模板時，都無法擴增出目標產(chǎn)物；將兩種質(zhì)粒混合物作為模板時，很好地擴增出目標產(chǎn)物（圖1-A）。經(jīng)序列測定，該PCR 產(chǎn)物中間為CDK4基因，兩端多余序列分別源自pcDNA3.1 與pEGFP_C2（圖1-B）。該DNA 片段長1 057 bp，恰好為86 bp，909 bp（CDK4基因除終止密碼TGA 之外的長度），61 bp 之和（圖1-C）?？梢娖叫心０宸o法避免對原始野生型基因的擴增。

2.2 兩種方案下目標基因的擴增

為驗證旁側(cè)引物法的優(yōu)點，以在pEGFP_C2-CDK4基礎上制作其活性缺失突變體CDK4_D158N為例，采用常規(guī)末端引物與旁側(cè)引物進行并行OEPCR 操作。常規(guī)末端引物分別為匹配CDK4基因兩端序列的CDK4_S（含EcoR I 位點與3 個保護堿基）與CDK4_A（含SalI 位點與2 個保護堿基）；旁側(cè)引物pEGFP_C5′位于EcoRI 位點上游75 bp，旁側(cè)引物pEGFP_C3′位于SalI 位點下游61 bp（圖2-A）。

圖1 平行模板法仍能擴增原始基因

第一輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，得到各自所需的4 個片段（圖2-B）。將a+b 組合，c+d 組合進行第二輪PCR，兩者皆得到相應的目標產(chǎn)物（圖2-C）。且電泳結(jié)果顯示采用旁側(cè)引物時各PCR 產(chǎn)物都略大于常規(guī)末端引物下的產(chǎn)物，與預期相符。

圖2 OE-PCR 擴增含點突變的目標基因

2.3 突變體的克隆與鑒定

為檢測不用酶切時間對常規(guī)末端引物法的影響，對上述3 號產(chǎn)物（圖2-C）的雙酶切設置1 h 與4 h兩個時間組，以對比其效率差異。電泳結(jié)果顯示不同酶切作用時間下產(chǎn)物大小基本一致，看不出三者的明顯區(qū)別（圖3-A）。由于此時識別位點位于DNA末端，雙酶切只會使其縮短11 bp，故難以通過電泳結(jié)果判斷酶切作用是否充分。

為檢測旁側(cè)引物法下切除兩端多余序列后對終產(chǎn)物大小的影響，對7 號產(chǎn)物（圖2-C）用EcoRI與SalI 以不同的組合方式進行酶切。考慮到此時識別位點位于DNA 中間，酶切效率高，故僅設置一個短時間組。電泳檢測發(fā)現(xiàn)4 種酶切組合下的產(chǎn)物大小不同，其中雙酶切產(chǎn)物最小，且條帶單一（圖3-B），說明該產(chǎn)物已被充分酶切。

圖3 第二輪PCR 及酶切結(jié)果

將上述雙酶切產(chǎn)物連入載體后經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以篩選目標突變體。常規(guī)末端引物下酶切1 h 組只長出3 個菌落，經(jīng)PCR 檢測，其中僅一個陽性克?。▓D4-A），陽性率僅33%。常規(guī)末端引物下酶切4 h 組長出數(shù)十個菌落，任意挑取10 個菌落進行PCR 檢測，得到7 個陽性克?。▓D4-B），陽性率達70%。旁側(cè)引物雙酶切1 h 組長出數(shù)百個菌落，任意挑取10 個菌落進行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)全部都是陽性克?。▓D4-C），陽性率100%；對這10 個陽性克隆提取質(zhì)粒進行序列測定，結(jié)果顯示全部都是pEGFP_C2-CDK4_D158N，即突變成功率為100%。

3 討論

圖4 不同方案下的平板篩選及菌落檢測結(jié)果

由于OE-PCR 定點突變程序繁瑣，很多科研工作者都試圖提出優(yōu)化方案，平行模板法即其中之一。然而，我們發(fā)現(xiàn)平行模板法并不能避免對原始野生型基因的擴增。結(jié)合具體實例，并不難分析其原理。由T7 promoter 與pEGFP_C3′引物各自完全延伸的單鏈DNA 雖然在CDK4區(qū)域互補，但是沒有配對的3′-OH 末端，無法繼續(xù)延伸。而PCR 反應中往往會有部分未完全延伸的產(chǎn)物，如果兩者恰好在各自的CDK4序列內(nèi)部中止延伸，那么這兩條單鏈DNA不只互補，且各有一個配對后的3′-OH 末端。因此可以互為模板繼續(xù)延伸，形成一條“雜交”DNA 雙鏈。其上游序列源自pcDNA3.1，中部為CDK4序列，下游序列源自pEGFP_C2。該“雜交”DNA 雙鏈可以作為后續(xù)循環(huán)的模板使目標基因CDK4得以擴增（圖5）。因此，試圖以平行模板法在一個小管內(nèi)完成OE-PCR 所有擴增反應的構(gòu)思是不成立的。

圖5 平行模板法擴增目標基因原理示意圖

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識別DNA 的特定序列并切開雙鏈DNA，若酶切位點靠近DNA 末端，則酶切效率受到不同程度的影響［19-20］。在設計引物時，往往在酶切位點外側(cè)添加1-3 個“保護堿基”以保證PCR 產(chǎn)物的酶切效率。盡管如此，其酶切效率有時也只能達到最大值的20%-50%（圖6-A）。低效酶切也成為基因克隆尤其是PCR 定點突變的重要制約因素。有兩種方法可提高此時的酶切效率，一是增加引物中“保護堿基”數(shù)目，但相應地會增加實驗費用，且非配對堿基數(shù)的增加還會降低PCR 成功率；二是增加酶切反應的酶量或（和）延長酶切作用時間，卻會增加內(nèi)切酶出現(xiàn)星號活性的風險。選用旁側(cè)引物可以很好地解決上述問題，且可以避免諸多不利因素。旁側(cè)引物位于酶切位點外側(cè)50 bp-100 bp，此時對PCR 產(chǎn)物酶切近似于甚至優(yōu)于從質(zhì)粒中切取基因片段（質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)會影響酶切效率），極大地提高酶切反應的效率（圖6-B），由此縮短反應時間，增加克隆形成數(shù)及陽性率。

圖6 旁側(cè)引物法提高PCR 產(chǎn)物酶切效率原理示意圖

除此之外，旁側(cè)引物法還有以下兩個優(yōu)點，一是雙酶切產(chǎn)物與非酶切或單酶切產(chǎn)物大小有一定差異，可以通過電泳結(jié)果直接判斷酶切是否充分（圖3-B）。另外，當突變位點靠近基因兩端時，采用常規(guī)末端引物會使第一輪PCR 產(chǎn)物之一偏小，不便于檢測及回收。此時采用旁側(cè)引物可以適當增加DNA片段長度，便于后續(xù)操作。旁側(cè)引物源于質(zhì)粒載體上的一段序列，只要插入該載體的基因，都可以之制作定點突變，不會過多增加實驗成本。

平行模板法雖無法避免原始基因的擴增，但是其擴增效率明顯低于同一個質(zhì)粒上、下游引物對目標基因的擴增。因此，我們認為仍可利用兩個平行質(zhì)粒分別作為第一輪PCR 上下游片段的擴增模板，以減少定點突變過程中原始質(zhì)粒對第二輪PCR的“污染”。如果在第一輪PCR 時選用兩種不同的平行質(zhì)粒，除非兩者同時污染各自的PCR 產(chǎn)物，否則第二輪PCR 不會擴增出原始基因，這樣就極大地減少了原始質(zhì)粒對后續(xù)操作的污染。

4 結(jié)論

本研究論證了平行模板法簡化OE-PCR 定點突變流程的思路不能成立。我們認為制約OE-PCR 定點突變效率的核心因素是靠近DNA 末端識別位點的低效限制性酶切。采用旁側(cè)引物法可提高PCR 產(chǎn)物的酶切效率，且便于通過電泳監(jiān)測酶切效果，既節(jié)省工作時間，又能大幅提高OE-PCR 定點突變的成功率。