楊妍妍 霍雨猛 吳雄 劉冰江

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點實驗室 國家蔬菜改良中心山東分中心 農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測實驗站，濟(jì)南 250100）

洋蔥（Allium cepaL.）是百合科蔥屬植物，是世界上重要的蔬菜之一，年產(chǎn)量位居第二位，僅次于番茄。在中國，洋蔥是主要的出口創(chuàng)匯蔬菜，由于其重要的營養(yǎng)和保健價值，越來越受到人們的歡迎，市場需求不斷提高。洋蔥起源于中亞，種質(zhì)資源嚴(yán)重匱乏。隨著對其品種特性的要求越來越高，改良洋蔥品種的綜合性狀顯得尤為重要。

洋蔥雜交種具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，高產(chǎn)、整齊度高、商品性好［1］。為了提高品種的雜種優(yōu)勢，需要高度純合親本自交系。由于洋蔥是典型的異花授粉作物，具有自交衰退現(xiàn)象，而且又是兩年生植物，通過常規(guī)育種手段很難實現(xiàn)高度純合這個目標(biāo)［2］。洋蔥自交系選育通常是通過多代自交分離純合而成，需要6-10 年，不僅周期長、費(fèi)工、費(fèi)時，而且育種效率較低。單倍體加倍獲得的雙單倍體具有純合速度快、用于選擇的群體小和隱性基因也能表達(dá)的優(yōu)點，是拓展種質(zhì)資源的高效方案，并能夠為選育洋蔥雜交種奠定材料基礎(chǔ)［3-4］。與傳統(tǒng)選育洋蔥自交系相比，雙單倍體系的選育時間短，僅需兩年就能獲得完全純合穩(wěn)定的自交系［5］。由于雙單倍體群體中的每個個體都是完全純合同質(zhì)的，可作為重要性狀的遺傳分析、分子標(biāo)記及數(shù)量性狀研究的理想材料。

分子標(biāo)記在遺傳多樣分析、重要性狀的輔助選擇、基因定位等方面具有重要的應(yīng)用意義，直接反映了個體間DNA 的遺傳多態(tài)性。前人利用RFLP、SSR 等分子標(biāo)記在黃瓜、甜瓜、馬鈴薯等多種蔬菜作物上鑒定單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)再生植株的純合性和雜合性［6-11］。在洋蔥中，由于開發(fā)的標(biāo)記較少，至今相關(guān)研究開展有限，主要以RAPD 標(biāo)記對單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)的再生植株與其供體親本進(jìn)行比較分析，未見有利用穩(wěn)定性更高的共顯性標(biāo)記進(jìn)行純合性鑒定的報道［12-13］。

本研究通過離體雌核發(fā)育途徑培養(yǎng)誘導(dǎo)洋蔥未受精花蕾產(chǎn)生單倍體/雙單倍體再生植株，利用共顯性的雄性不育基因分子標(biāo)記對再生植株進(jìn)行檢測，從而鑒定再生植株的來源與純合性，以期為有效利用洋蔥單倍體奠定基礎(chǔ)，為我國洋蔥種質(zhì)資源創(chuàng)新、雜交種選育、基因工程等相關(guān)研究提供重要材料支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇引自日本瀧井種苗株式會社（Takii Seed）的3 個中日照類型洋蔥雜交種“阿盾”（ATON）、“地球”（EARTH）和“大寶”（TABAO），種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗基地。鱗莖收獲后在適宜的條件下貯存，當(dāng)年10 月底栽種鱗莖。開花期選擇直徑為2.5-3.5 mm 的未開放花蕾接種在B5培養(yǎng)基（含2 mg/L 2，4-D、2 mg/L 6-BA 和100 g/L蔗糖）上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得再生植株［14］。

1.2 方法

1.2.1 再生植株倍性鑒定方法 利用流式細(xì)胞儀對再生植株進(jìn)行倍性鑒定。取10 mg 新鮮葉片，加入0.5 mL 的Partec HR-A 溶液（分離細(xì)胞核的檸檬酸緩沖液）研磨。將樣品通過30 μmol/L PartecCelltricsTM微孔膜過濾到測試管中，加0.5 mL PartecHR-B 溶液（DAPI 溶液）于樣品中，利用德國Partec PA 流式細(xì)胞儀測定植株細(xì)胞DNA 的相對含量。并繪出DNA曲線圖。將已知倍性的二倍體洋蔥的相對熒光強(qiáng)度為參照標(biāo)準(zhǔn)確定供試樣品的倍性水平。

1.2.2 DNA 提取 選取洋蔥再生植株新鮮葉片，迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂锰旄萍迹ū本┯邢薰旧a(chǎn)的快捷型植物基因組DNA 提取系統(tǒng)（DP321）提取洋蔥的基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測DNA 的濃度和質(zhì)量。

1.2.3 再生植株的分子標(biāo)記檢測 對獲得的再生植株利用洋蔥細(xì)胞核育性基因的分子標(biāo)記DNF-566 和RNS-357［15］對源于雜交種“阿盾”的再生植株進(jìn)行純合性檢測。利用多重PCR 標(biāo)記ACSKP1［16］對源于雜交種“大寶”、“地球”的再生植株進(jìn)行純合性檢測，標(biāo)記所用引物（表1）由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包括rTaq 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP mix（2.5 mmol/L）2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL、基因組DNA 模板2 μL、0.5 μmol/L 上下游引物各1 μL、50 ng/L 模板DNA 1 μL，加ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)再生植株和供體二倍體原始材料在Ms基因位點擴(kuò)增片段的差異進(jìn)行純合性分析。

表1 分子標(biāo)記檢測所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 未受精花蕾在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的發(fā)育與植株再生

將直徑為2.5-3.5 mm 的未開放洋蔥花蕾接種在添加2 mg/L 2，4-D、2 mg/L 6-BA 和100 g/L 蔗糖的B5 培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，2-3 d 后花蕾在培養(yǎng)皿中可正常開放，5-6 d 后花藥敗育，子房開始膨大。50 d 后，有體細(xì)胞胚從子房中長出，并且具有完整的植株結(jié)構(gòu)。3-4 個月后胚達(dá)到最多，5 個月以后幾乎不會出現(xiàn)。將所獲得的雌核發(fā)育胚轉(zhuǎn)移至不含激素的含有30 g/L 蔗糖的B5 培養(yǎng)基中，經(jīng)過5 d 左右發(fā)育成正常植株（圖1）。

圖1 未受精洋蔥花蕾在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的發(fā)育過程

2.2 再生植株的倍性鑒定

以洋蔥正常二倍體葉片的細(xì)胞懸浮液為對照，將待測試再生植株葉片的細(xì)胞懸浮液在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二倍體植株在相對熒光強(qiáng)度140 處出現(xiàn)分離峰（圖2-A），據(jù)此判定分離峰出現(xiàn)在相對熒光強(qiáng)度70 處的為單倍體（圖2-B）。結(jié)果表明，通過離體誘導(dǎo)培養(yǎng)洋蔥未受精花蕾，可以獲得單倍體再生植株，“阿盾”、“地球”、“大寶”3個品種的單倍體誘導(dǎo)率分別為3.93%、4.84%和4.10%。同時也獲得了7 株二倍體，其中4 株為雙單倍體（表2）。

圖2 洋蔥二倍體和單倍體植株的DNA 含量分布圖

表2 洋蔥雌核發(fā)育誘導(dǎo)再生植株情況

2.3 基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測

利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒提取洋蔥再生植株基因組總DNA。隨機(jī)選取10 個DNA 樣本，每個樣本取5 μL DNA 與2 μL 6×Loading buffer 混 勻，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示提取的DNA 樣品在點樣孔處沒有明顯殘留，說明多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低。電泳條帶清晰無降解現(xiàn)象且基本位于同一位置。在紫外可見分光光度計上檢測OD260/OD280值在1.8-2.0 之間，表明提取的DNA 純度較高，可以用于下一步PCR 擴(kuò)增試驗。

2.4 再生植株的分子標(biāo)記鑒定

為了鑒定再生植株是否為純合體，利用DNF-566 和RNS-357 標(biāo)記對源于雜交種“阿盾”的12 株再生植株的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖3）。發(fā)現(xiàn)有8 株材料（1-5、8、11-12）擴(kuò)增出一條357 bp的條帶，表明這8 株材料在Ms位點的基因型為純合的msms。4 株材料（6、7、9-10）擴(kuò)增出一條566 bp 的條帶，表明這4 株材料在Ms位點的基因型為純合的MsMs。

利用AcSKP1 標(biāo)記對源于雜交種“地球”的15株再生植株的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖4）。有9 株只擴(kuò)增出898 bp 的條帶，6 株只擴(kuò)增出628 bp 的條帶，說明檢測的所有材料在Ms位點的基因型均為純合的。來源于“大寶”的16 株再生植株中，有11 株（16、18-23、25-26、30-31）擴(kuò)增出898 bp 條帶，2 株（17、24）擴(kuò)增出628 bp 條帶，表明這13 株材料在Ms位點的基因型是純合的。有3 株（27-29）擴(kuò)增出了898 和628 bp 2 條片段，擴(kuò)增后表現(xiàn)出了與供體材料相同的帶型，表明這3 株則是雜合的二倍體，可能由子房壁或其他體細(xì)胞發(fā)育而來。檢測的再生植株供體材料來源于3 個雜交種，在Ms位點的基因型是雜合的（Msms），而檢測的材料絕大多數(shù)是純合的，說明這些再生植株源于雌配子體，是通過雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的。

圖3 DNF-566 和RNS-357 標(biāo)記在部分雌核發(fā)育誘導(dǎo)再生植株材料中的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 AcSKP1 標(biāo)記在源于雜交種“地球”和“大寶”的雌核發(fā)育誘導(dǎo)再生植株材料中的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

洋蔥基因組龐大（15 290 Mb）［17］，并且重復(fù)序列多［18］，GC 含量僅為32%［19］，分子標(biāo)記研究相對落后，因此，在洋蔥分子標(biāo)記鑒定再生植株純合性研究方面鮮見報道。Javornik 等［13］利用RAPD 標(biāo)記檢測離體雌核發(fā)育再生植株，與供體親本相比，總共擴(kuò)增的4 600 個RAPD 片段在誘導(dǎo)率高的品系中未發(fā)現(xiàn)變異，而在誘導(dǎo)率較低的品系中，檢測到2個RAPD 片段的存在微小變化。但是RAPD 標(biāo)記一般是顯性遺傳（極少數(shù)是共顯性遺傳的），這樣對擴(kuò)增產(chǎn)物的記錄就可記為“有/無”，這也意味著不能鑒別雜合體和純合體。Yang 等［15］開發(fā)出了一對與顯性等位基因Ms連鎖的SCAR 標(biāo)記DNF-566 和與隱性等位基因ms共分離的SCAR 標(biāo)記RNS-357。以此標(biāo)記為基礎(chǔ)，Huo 等［16］開發(fā)出共顯性的多重PCR 分子標(biāo)記AcSKP1，只需經(jīng)過一次簡單的PCR經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可直接準(zhǔn)確鑒定Ms位點的基因型（MsMs、Msms、msms）。相對于RAPD 標(biāo)記，SCAR 標(biāo)記所用引物較長且引物序列與模板DNA 完全互補(bǔ)，可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，因此，結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)?；谏鲜鰞?yōu)點，應(yīng)用洋蔥雄性不育基因Ms位點的標(biāo)記鑒定誘導(dǎo)再生植株的純合性，這也是該標(biāo)記在單倍體鑒定應(yīng)用中的首次報道。

洋蔥雜交種在Ms位點的基因型為雜合的Msms，通過雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得植株，如果為配子體起源，不管其為單倍體或雙單倍體，分子標(biāo)記位點并未發(fā)生改變，應(yīng)該只具有親本的Ms或ms，即為純合的MsMs或msms。如果為體細(xì)胞起源，應(yīng)該具有和供體親本相同的雜合基因型Msms。本研究中鑒定的43 株再生植株中有40 株是在Ms位點是純合的，說明這40 株是起源于雌配子體的純合植株，其余3 株是雜合的，表明其來源于供體親本的體細(xì)胞組織。本研究通過流式細(xì)胞儀和洋蔥雄性不育基因Ms位點分子標(biāo)記對每個離體雌核誘導(dǎo)再生植株進(jìn)行了鑒定，獲得了4 株雙單倍體，確認(rèn)為自然加倍而成的雙單倍體。這個結(jié)果與前人［20-22］報道10%左右的自然加倍率的結(jié)果基本一致。由于本試驗是離體雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)洋蔥通過胚狀體發(fā)育而成的再生植株，沒有經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)階段，因此在遺傳上具有相對的穩(wěn)定性。獲得的雙單倍體再經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)類型鑒定，可以作為候選不育系、保持系或父本系，也可為建立高密度的遺傳連鎖圖奠定材料基礎(chǔ)［23］。

4 結(jié)論

洋蔥雄性不育基因Ms位點的分子標(biāo)記不僅可以作為鑒定洋蔥細(xì)胞核育性的分子標(biāo)記，而且可以用于洋蔥單倍體再生植株與供體雜交種親本的同源性與純合型分析，與流式細(xì)胞儀結(jié)合可以快速準(zhǔn)確鑒定出雙單倍體。