嚴(yán) 寬，劉 杰，魏 琴，謝 浩

（1.宜賓學(xué)院川茶學(xué)院；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，宜賓 644000）

油樟[Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao]主要分布于四川省，其莖、葉等器官可以煉取大量精油，主要為萜類化合物，包含了1,8-桉葉油素、α-松油醇、γ-松油烯等化學(xué)物質(zhì)。油樟精油具有一定的功效性，包括消炎、殺菌和抗氧化等作用。植物內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)植物的次生代謝是通過特定的信號分子和其相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的。隨著對信號分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究，發(fā)現(xiàn)在許多植物體中MeJA都發(fā)揮著重要的信號分子作用[1]。在施加外源MeJA時，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御機(jī)制，誘發(fā)多種次生代謝產(chǎn)物的生成[2]。因此，本實驗通過對內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生揮發(fā)油合成過程中MeJA作用的研究，來探討內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子與油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油合成過程中的MeJA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以便在未來關(guān)于油樟細(xì)胞中次級代謝的調(diào)控規(guī)律能夠有更深入的了解，從而可以找到提高調(diào)控油樟細(xì)胞揮發(fā)油產(chǎn)量的方法。

1 方法與材料

1.1 材料來源與處理

從宜賓紅巖山油樟基地（位于27°50'N;105°20'E）采集了油樟葉的樣本。內(nèi)生真菌（Penicillium commune，2J1）從油樟植物中分離出來，將這些真菌培養(yǎng)并保存在PDA培養(yǎng)基內(nèi)。

1.2 建立油樟細(xì)胞懸浮體系

選用生長良好的油樟幼嫩葉片培養(yǎng)愈傷組織后，繼代培養(yǎng)2-3次。之后選取色澤鮮亮、長勢良好，質(zhì)地疏松的嫩黃色愈傷組織，約2.0g/瓶，25℃，遮光，振蕩培養(yǎng)（120 r·min-1）。每隔7 d繼代一次，連續(xù)繼代2-3次[3]。

1.3 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的制備

將一株青霉菌屬(Penicilliumsp.)的內(nèi)生真菌接種到配置好的PDA液體培養(yǎng)基中，在28℃，130r/min的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，之后將2J1的菌體與發(fā)酵液進(jìn)行分離，將內(nèi)生真菌2J1的菌體破碎成勻漿之后與發(fā)酵液混合，進(jìn)行減壓抽濾，最后在高溫高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min，便可得到內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子。采用蒽酮-硫酸法測定誘導(dǎo)子糖含量[4]。

1.4 油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油的提取與測定

精確稱取烘干之后的油樟細(xì)胞0.3g，加入環(huán)己烷冷浸過夜（環(huán)己烷與細(xì)胞的比例為4：1），隨后進(jìn)行30min的超聲提取，在5000r/min的超速離心機(jī)上離心4min，提取上清液，定容到5mL。用針筒抽取液體，濾膜過濾至上樣瓶中，測定揮發(fā)油的含量，用GC-MS分析[5]。1,8-桉葉油素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=73900X-299200，R2=0.9993。

1.5 油樟懸浮細(xì)胞中MeJA含量的測定

油樟懸浮細(xì)胞中MeJA含量采用頂空固相微萃取技術(shù)測定[14]。標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=7676.9x+6234.5 R2=0.9985

1.6 數(shù)據(jù)軟件及處理

揮發(fā)油的產(chǎn)量和實驗處理使用三次重復(fù)測量。所有相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行路徑系數(shù)分析統(tǒng)計19.0和Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對油樟懸浮細(xì)胞MeJA釋放量和揮發(fā)油積累的影響

在培養(yǎng)7d的油樟懸浮細(xì)胞中加入內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子40mg/L，以加入等量的PDA培養(yǎng)基為對照組?？疾?J1誘導(dǎo)子對油樟懸浮細(xì)胞內(nèi)MeJA含量和揮發(fā)油積累的影響。經(jīng)過油樟內(nèi)生真菌2J1處理后的油樟懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)至第21d時誘導(dǎo)效果最好，產(chǎn)生的揮發(fā)油含量較高；但是誘導(dǎo)的時間過長，油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油產(chǎn)量反而有所減少。

2.2 MeJA釋放和揮發(fā)油積累與不同油樟內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子濃度的關(guān)系

分別向培養(yǎng)了7d的油樟懸浮細(xì)胞中加入濃度為0mg/L、20mg/L、40 mg/L、60mg/L、80mg/L的內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子，在油樟懸浮細(xì)胞分別培養(yǎng)21h和14d后檢測不同濃度誘導(dǎo)子對油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生的MeJA釋放和揮發(fā)油的積累的影響。

2.3 MeJA對內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油合成的影響

為了更好的了解內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子通過化學(xué)信號MeJA誘導(dǎo)促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生揮發(fā)油的作用機(jī)制，在油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)到7d后進(jìn)行了如下處理，設(shè)置了如下圖中的對照試驗，通過檢測其中各組中油樟懸浮細(xì)胞MeJA（圖1）和揮發(fā)油的合成情況（圖2）進(jìn)行分析研究，其中內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子、SHAM、外源MeJA的添加濃度分別為40 mg/L、2mmol/L、100μmol/L。檢測油樟懸浮細(xì)胞MeJA釋放量的時間為處理后21h，檢測油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油的合成時間為處理后14d。

結(jié)果表明，添加外源MeJA可以促使油樟細(xì)胞中的揮發(fā)油合成。而SHAM則可抑制細(xì)胞中MeJA的積累，并導(dǎo)致?lián)]發(fā)油產(chǎn)量的降低。但是，添加SHAM沒有使內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的油樟細(xì)胞揮發(fā)油的合成量削減完全，因此在油樟懸浮細(xì)胞中可能存在由MeJA作為信號分子的調(diào)控?fù)]發(fā)油合成的信號途徑。

3 討論

由于內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子屬于細(xì)胞外的物質(zhì)不能直接進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，所以需要依靠植物細(xì)胞膜外的特異性受體，當(dāng)它與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后，便會使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生出一些特定的胞內(nèi)信使物質(zhì)，這些信使物質(zhì)可以通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而實現(xiàn)對特定基因的調(diào)控作用，使植物細(xì)胞中的防御性次生代謝系得以激活，進(jìn)而可以使植物次生代謝產(chǎn)物合成增加[6]。因此，MeJA的迸發(fā)可能是經(jīng)2J1粗誘導(dǎo)子處理后出現(xiàn)的前期反應(yīng)，MeJA可能屬于胞內(nèi)的一種信使物質(zhì)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，成功誘導(dǎo)了油樟細(xì)胞中揮發(fā)油產(chǎn)量的提升。本研究雖然對MeJA介導(dǎo)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對油樟揮發(fā)油合成的調(diào)控機(jī)制做了進(jìn)一步研究。因此為了能夠使誘導(dǎo)子充分的發(fā)揮其誘導(dǎo)作用，關(guān)于內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子的純度和結(jié)構(gòu)有必要做進(jìn)一步的純化和檢測，以此來研究誘導(dǎo)子更好的制備和保存方法[7]。由此實驗還可以推測出存在著其他途徑引起油樟細(xì)胞中揮發(fā)油的合成與積累。植物次生代謝產(chǎn)物的合成途徑是非常復(fù)雜的，可能還存在其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這仍需進(jìn)一步的研究。

圖1 各組中MeJA的累積情況

圖2 各組中揮發(fā)油的累積情況