金蟬花核苷類成分的LC-MS定性分析與HPLC含量測定

葛 琦，萬晶瓊，朱益靈，王一姝，何小翠，魏 淵，歐陽臻

1江蘇大學藥學院；2江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013

金蟬花(Cordycepscicadae)為麥角菌科真菌大蟬草寄生在蟬若蟲后形成的干燥復合體，與冬蟲夏草的無性型同屬，在民間是一種具有補益作用的中藥[1]，其性寒味甘，具疏散風熱、定驚鎮(zhèn)痙等功效，在我國主要分布于江蘇、浙江、安徽、云南、廣東、四川等省[2]。天然冬蟲夏草生長周期長，對生長環(huán)境要求較高，產量較少，價格昂貴，近年來對冬蟲夏草的過度采收導致其資源枯竭。現有研究表明，金蟬花與冬蟲夏草化學成分相似，主要包括多糖、核苷、甘露醇、麥角甾醇等[3]；功效相近，具有保肝護腎、抗衰老、抗腫瘤、免疫調節(jié)和鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等[4]活性，應用前景廣闊，有望開發(fā)成為冬蟲夏草的代用品和藥食兩用新資源。

核苷類物質是蟲草屬的主要功效成分，具有補益、增強免疫、保護神經、抗氧化、抗癌、抗病毒和抗菌等[5]生物活性，在蟲草屬中發(fā)現的核苷類成分主要包括尿苷、腺嘌呤、鳥苷、蟲草素、肌苷、N6-(2-羥乙基)腺苷等[6]。Sun等[7]建立HPLC-DAD法測定三種蟲草發(fā)酵液與菌絲體中核苷類成分的含量。Chen等[8]采用HPLC-MS方法，從金蟬花子實體65%乙醇提取物中分離鑒定出了6種核苷類化合物。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)方法對金蟬花水提取物中核苷類成分進行定性分析；建立高效液相色譜法(HPLC)同時對金蟬花中6種核苷類成分進行定量分析，并比較不同產地和不同部位(子實體和菌核)金蟬花中核苷類成分的含量差異，以期為金蟬花質量控制及進一步的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(安捷倫科公司)；LXQ線性離子阱質譜(賽默飛世爾科技公司)；ZF-250B超聲波清洗器(上海致豐電子科技有限公司)；BSA 124S分析電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；RO-MB-10D高純水機(杭州永潔達膜分離設備廠)。

1.2 材料

腺苷對照品(批號161204，純度≥98%)，購自成都植標化純生物科技有限公司；腺嘌呤對照品(批號LA170651，純度≥98%)、尿苷對照品(批號NU20170329，純度≥98%)、肌苷對照品(批號JI191220，純度≥98%)、鳥苷對照品(批號LG191201，純度≥98%)，均購自合肥博美生物科技有限公司；HPLC級甲醇、HPLC級醋酸，均購自國藥集團化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水。

14批金蟬花樣品采收自浙江、江蘇、安徽、湖南、湖北、四川、福建和云南等地，由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為Cordycepscicadae，保存于江蘇大學藥學院藥材管理室。樣品信息見表1。

表1 金蟬花藥材信息Table 1 The information of Cordyceps cicadae samples

2 方法與結果

2.1 金蟬花的HPLC-MS定性分析

2.1.1 供試品溶液的制備

精密稱取金蟬花粉末(過 50 目篩) 0.20 g，于具塞錐形瓶中，加入10 mL超純水，超聲提取(300 W，40 kHz)30 min后過濾，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 色譜條件

Supersil AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ODS3預柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脫：0～10 min為0%A，10～20 min為0%A～5%A，20～30 min為5%A～15%A，30～40 min為15%A，40～50 min為15%A～20%A；流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為260 nm，進樣量為10 μL。

2.1.3 質譜檢測條件

電噴霧離子源，正離子模式；鞘氣流速10.5 L/min；輔助氣1.5 L/min；噴霧電壓4.5 kV；毛細管溫度325.00 ℃；毛細管電壓-30.00 V；透鏡電壓-120.00 V；質量掃描范圍m/z50.00～500.00。

2.1.4 定性分析結果

采用正離子模式進行分子量分析。根據各色譜峰的相對分子量(m/z)、保留時間(tR)、紫外特征、分子離子峰及主要碎片峰信息，參照結合相關文獻[11-17]、SciFinder和化學專業(yè)數據庫等天然產物數據庫收錄的天然產物，對HPLC圖譜進行峰歸屬分析，初步鑒定出13個核苷類成分為胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、N6-(2羥乙基)腺嘌呤、脫氧胞苷、次黃嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷。金蟬花核苷類成分的UV圖和質譜總離子流圖見圖1，13個化合物的質譜數據見表2。

圖1 金蟬花樣品UV圖(A)及總離子流圖(B)Fig.1 UV chromatogram and LC-MS total ion current chromatogram of Cordyceps cicadae

表2 金蟬花核苷類成分HPLC-MS定性分析結果Table 2 Qualitative analysis of nucleosides by HPLC-MS

注：a經過對照品確認。

Note:aConfirmed by reference substance.

2.2 HPLC同時測定金蟬花中6種核苷類成分的含量

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷對照品28.0、57.2、41.8、13.6、57.1、34.1 mg，置于20 mL容量瓶中。加超純水定容至刻度，溶解搖勻，得混合對照品儲備液(腺嘌呤1.400 mg/mL、尿苷2.860 mg/mL、肌苷2.090 mg/mL、鳥苷0.680 mg/mL、腺苷2.855 mg/mL和N6-(2-羥乙基)腺苷 1.705 mg/mL)。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 線性關系的考察

分別精密吸取混合對照品適量，逐級稀釋成5個系列濃度的混合對照品溶液。按照2.1.2節(jié)色譜條件進行測定，在該條件下腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷在樣品中得到良好的分離，峰型較好。出峰時間分別為10.2、24.4、32.5、33.4、34.2和44.7 min，見圖2。以腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以各對照品峰面積Y為縱坐標對質量濃度X(μg/mL)進行線性回歸，得出回歸方程及相關系數。結果見表3，表明6個核苷類成分的線性關系良好。

2.2.2.2 儀器精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按2.1.2節(jié)色譜條件重復測定6次，記錄峰面積，并計算得6個對照品的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷峰面積的RSD分別為0.89%、0.71%、0.87%、0.89%、0.88%和0.90%，表明儀器精密度良好。

圖2 混合對照品(A)和金蟬花樣品(B)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of standard sample (A) and the Cordyceps cicadae sample (B) 注：2-腺嘌呤；7- 尿苷； 10-肌苷；11-鳥苷；12-腺苷；13- N6-(2-羥乙基)腺苷(N6-(2-Hydroxyethyl) Adenosine。Note:2- Adenine;7- Uridine;10- Inosine;11- Guanosine;12- Adenosine;13- N6-(2- Hydroxyethyl) adenosine.

表3 6種核苷類成分的線性方程、相關系數和線性范圍、定量限和檢測限Table 3 The regression equations,correlation coefficient,linear ranges,LOQ and LOD of 6 investigated nucleosides

2.2.2.3 方法精密度試驗

2.2.2.3.1 日內精密度試驗

取同批供試品溶液，按2.1.2節(jié)色譜條件重復測定6次，記錄峰面積，并計算得峰面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)分別為0.19%、1.68%、1.02%、0.89%、1.12%和0.63%，表明日內精密度良好。

2.2.2.3.2 日間精密度試驗

取同批供試品溶液，按2.1.2節(jié)色譜條件每日相同時間段連續(xù)進樣3天，每天測定3次，記錄峰面積，并計算得峰面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)分別為1.96%、0.49%、2.50%、1.17%、1.69%和0.66%，表明日間精密度良好。

2.2.2.4 加樣回收試驗

精密稱取同一金蟬花樣品粉末(過50目篩) 0.2 g，共6份，分別精密加入6種對照品溶液各1 mL，按照1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按2.1.2節(jié)色譜條件測定，由回歸方程計算樣品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷的平均回收率分別為101.20%、99.87%、97.32%、101.33%、100.03%、102.37%，RSD分別為0.29%、0.37%、0.45%、0.41%、0.47%和0.38%，表明該方法的加樣回收效果較好。

2.2.2.5 重復性試驗

分別精密稱取同一金蟬花樣品粉末(過50目篩)0.2 g，共6份，按照2.1.1節(jié)方法制備供試品溶液，按照2.1.2節(jié)色譜條件進行測定，根據回歸方程計算樣品中6種核苷成分的含量及RSD值。腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷峰面積的RSD分別為0.20%、 0.17%、 0.26%、 0.30%、0.21%和0.17%，表明方法重復性良好。

2.2.2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一蟬花粉末(過50目篩)0.2 g，按照2.2.1節(jié)方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、20、24 h，按照2.1.2節(jié)色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算RSD值，腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷峰面積的RSD分別為0.83%、0.81%、0.50%、0.75%、0.76%和0.56%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性較好。

2.2.3 不同產地金蟬花核苷類成分含量測定

對14個不同產地的金蟬花樣品，按照2.2.1方法制備供試品溶液，2.1.2色譜條件測定樣品中核苷類成分。記錄峰面積，根據回歸方程計算樣品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷成分的含量。

由表4可知，14批金蟬花中的6個核苷類成分含量存在差異，其中安徽大別山樣品的6種核苷總量最高為4 159.69 μg/g，福建三明的最低為2 987.44 μg/g。尿苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷的含量在不同產地之間差異較小，而肌苷和腺嘌呤含量差異較大，云南昆明樣品肌苷含量是江西九江樣品的9.6倍，安徽大別山樣品中腺嘌呤是福建三明樣品的4.4倍。N6-(2-羥乙基)腺苷是蟲草屬中一種特有的核苷類成分且含量較高，在江蘇句容金蟬花樣品中含量達到921.91 μg/g。

表4 金蟬花中6種核苷類成分含量(μg/g，n=3)Table 4 Contents of 6 investigated nucleosides in Cordyceps cicadae(μg/g，n=3)

2.2.4 不同部位金蟬花中核苷類成分含量測定

將14個產地的金蟬花藥材分別分為子實體和菌核兩部分，按照2.1.1節(jié)供試品溶液制備方法，2.1.2節(jié)色譜條件進行含量測定。記錄峰面積，根據回歸方程計算不同產地金蟬花樣品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷成分的含量，結果見表6和圖3。

對金蟬花不同部位核苷類成分含量分析，結果顯示不同部位核苷類成分的含量存在明顯差異，菌核中N6-(2-羥乙基)腺苷含量明顯高于子實體，子實體中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷含量則高于菌核，且肌苷和腺嘌呤的含量差異顯著，子實體中含量分別為菌核的倍9.2和3.3倍，兩個部位中尿苷含量均較高，分別占到了6種核苷類總量的32.0%和34.9%。

表6 金蟬花子實體和菌核中6種核苷類成分的含量(μg/g，n=3)Table 6 Contents of 6 investigated nucleosides in synnemata and sclerotium of Cordyceps cicadae(μg/g，n=3)

圖3 金蟬花子實體和菌核中6種 核苷類成分的含量(μg/g，n=3)Fig.3 Contents of 6 investigated nucleosides in synnemata and sclerotium of Cordyceps cicadae(μg/g，n=3) 注：2-腺嘌呤；7- 尿苷； 10-肌苷；11-鳥苷；12-腺苷；13- N6-(2-羥乙基)腺苷(N6-(2-Hydroxyethyl) Adenosine。Note:2- Adenine;7- Uridine;10- Inosine;11- Guanosine;12- Adenosine;13- N6-(2- Hydroxyethyl) adenosine.

3 討論

金蟬花水提取物HPLC-MS定性分析共鑒定出13種核苷類成分，分別為胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、N6-(2羥乙基)腺嘌呤、脫氧胞苷、次黃嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷，其中脫氧胞苷和脫氧肌苷為首次在金蟬花中被鑒定。

腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷在金蟬花樣品中含量較高，腺嘌呤能促進白細胞生長，從而改善腫瘤化療引起的白細胞減少癥及急性粒細胞減少癥[14]；尿苷參與肝臟解毒物質葡萄糖醛酸的合成，提高細胞耐缺氧能力，提高機體抗體水平[15]；鳥苷對急性缺血性腦卒中具有神經保護作用，可抑制缺血性卒中后梗死周邊的星形膠質反應和小膠質細胞活化[16]；腺苷廣泛存在于細胞液中，在機體的中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[17]。因此，本研究對以上6種核苷類成分建立HPLC同時測定的方法，以期為金蟬花的質量控制提供依據。

對不同產地的金蟬花樣品中核苷類成分分析顯示，不同產地的金蟬花樣品核苷類成分含量有明顯差異，安徽大別山和江蘇句容的6種核苷類總量相對較高，浙江天目山、安徽宣城和福建三明相對較低；金蟬花中腺苷(614.33 μg/g)與人工冬蟲夏草(607 μg/g)和野生冬蟲夏草(597 μg/g)含量相當[18]，腺嘌呤、尿苷、肌苷和鳥苷也均與野生冬蟲夏草含量相近。目前冬蟲夏草中未檢出N6-(2-羥乙基)腺苷成分，而在本研究中發(fā)現N6-(2-羥乙基)腺苷在金蟬花總含量僅次于尿苷，其均值為692.12 μg/g。文獻報道，N6-(2-羥乙基)腺苷具有腎功能保護，鎮(zhèn)痛和抗腫瘤的功效[19]，是一種核苷類功效成分。因此，認為金蟬花中核苷類成分含量豐富，亦是一種優(yōu)質蟲草。

不同部位的金蟬花樣品中核苷類成分分析表明，子實體中核苷類成分總量高于菌核，且子實體中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量均較高，其中肌苷在子實體中含量為菌核的9.2倍，而菌核中N6-(2-羥乙基)腺苷含量較高。Li等[20]通過建立10批金蟬花不同部位核苷類成分的HPLC指紋圖譜，分析顯示子實體中核苷類總量顯著高于菌核，與本研究結果基本一致。以上結果可為金蟬花質量控制提供參考及藥材資源的綜合開發(fā)利用提供理論支撐。