張 鑫，梁建東*，田維毅，梁宗琦

1貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院；2貴州大學真菌資源研究所，貴陽 550025

微生物是新型天然產(chǎn)物的重要來源，在藥物發(fā)現(xiàn)等領域具有不可替代的應用[1]。如今，隨著宏基因組學技術的發(fā)展，賦予了挖掘微生物天然產(chǎn)物的新內(nèi)涵?；蚪M測序顯示，微生物基因組，尤其是真菌基因組，包含大量的基因簇，具有比預期更加豐富的天然產(chǎn)物，它們可能產(chǎn)生結構更多樣化的次生代謝物，但是在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下，許多微生物基因簇保持沉默。近年已發(fā)展了一些激活這些神秘基因的手段，其中，基于微生物組學原理及方法的合成微生物群落共培養(yǎng)研究正在興起[2]。筆者從合成微生物群落共培養(yǎng)的價值與構建方法、共培養(yǎng)產(chǎn)物的檢測和微生物群落的共培養(yǎng)應用等方面對國內(nèi)外有關合成微生物群落共培養(yǎng)的研究進行概述，旨在為合成微生物群落共培養(yǎng)的進一步深入研究及開發(fā)應用提供參考。

1 合成微生物群落的共培養(yǎng)體系

合成微生物群落是在成分明確的基質條件下，人工創(chuàng)建的兩個或多個物種共培養(yǎng)的微生物群體系[3]。合成微生物群落通過微生物之間的相互作用實現(xiàn)特定功能，其中的微生物能夠通過相互交流和分工行使不同的復雜功能，具有復雜度低、可控性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。合成微生物群落中存在多種相互作用，這些相互作用可以通過改變細胞間交流、物種代謝作用以及空間結構等方式進行調(diào)控，從而實現(xiàn)對合成群落的改造[4]。在自然界和人類社會中，微生物群落在生物地球化學循環(huán)[5]，食物生產(chǎn)[6]，工業(yè)過程[7]以及人類健康和疾病[8]中皆發(fā)揮著重要作用。然而，傳統(tǒng)的微生物研究方法(如純分離和純培養(yǎng)等方法)一定程度上卻又制約著微生物的研究和應用。實則，微生物在自然界中，經(jīng)常以防御或營養(yǎng)競爭狀態(tài)生活在群落中，它們的相互作用產(chǎn)生多種次級代謝物。如，在細菌或真菌的生長環(huán)境中(土壤，根際，植物，粘膜和腸等)，微生物持續(xù)地相互作用，會導致復雜調(diào)節(jié)機制的激活，進而促使高度多樣化的天然產(chǎn)物的生物合成，例如信息素，防御分子和參與共生關聯(lián)的代謝物。此外，應激誘導分子(誘導子)表現(xiàn)出特異性的抗微生物，抗癌，和植物毒性活性[9]。為了發(fā)現(xiàn)新藥物，人們可借助這些相互作用，在化學生態(tài)學研究的框架內(nèi)，模仿自然存在的群落，構建(合成)一個人工群落，如，專門用于研究群落成員間對抗區(qū)天然產(chǎn)物誘導(主要發(fā)現(xiàn)新的活性化合物)的合成群落[10]。為進一步拓寬待研究物種和代謝產(chǎn)物的多樣性，研究者們基于微生物群落中菌株間發(fā)生的化學——生態(tài)互作關系，開發(fā)了新的培養(yǎng)微生物的方法——共培養(yǎng)法[11,12]，該方法自興起以來，受到越來越多的重視。

1.1 合成微生物群落共培養(yǎng)價值和策略

共培養(yǎng)(co-culture)是在一個培養(yǎng)容器中一起培養(yǎng)兩種或多種微生物的方法[13]。共培養(yǎng)可以在液體或固體培養(yǎng)基中進行。當使用液體培養(yǎng)時，該方法也稱為 “混合發(fā)酵”(mixed-fermentation)。

通常，共培養(yǎng)的策略是通過模擬自然生態(tài)，來構建人工的微生物群落[14]。在模擬自然微生物環(huán)境條件下，共培養(yǎng)可導致現(xiàn)有天然產(chǎn)物積累的增加[15]，或由于微生物串擾和化學防御而觸發(fā)沉默生物合成途徑的表達，產(chǎn)生新的化合物[4]。實現(xiàn)這些目標與微生物及其產(chǎn)生的酶和其他物質密切相關。酶抑制可以引起天然產(chǎn)物生物合成的誘導和抑制。向培養(yǎng)基中添加酶抑制劑可以阻斷某些生物合成途徑，從而將次級代謝物生物合成轉變?yōu)閺某聊虮磉_不良的基因簇產(chǎn)生其他天然產(chǎn)物[16]。在某些情況下，沉默通路的激活需要第二種微生物的存在，單獨的代謝物不總是足以誘導刺激代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，微生物間的相互作用是產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的必然驅動力，可能與空間/營養(yǎng)的競爭、寄生和拮抗等不同機制以及誘導植物防御反應有關[4]。共培養(yǎng)對于特定基因的激活取決于相互作用類型，可能會誘導由各種不相關途徑產(chǎn)生的代謝物。微生物共培養(yǎng)可以激活沉默基因簇，但實現(xiàn)這一目標的分子機制尚不十分明確。微生物可以產(chǎn)生具有轉錄調(diào)節(jié)和表觀遺傳修飾功能的化合物[17]。微生物的共培養(yǎng)還可以導致基因突變和其他沉默基因簇的表達，甚至整個基因片段的交換(水平基因轉移)，這可以產(chǎn)生以前未檢測到的化學結構[18]。共培養(yǎng)也可以監(jiān)測藥物對合成微生物菌群的影響，與藥物研究高度相關[19]，還能減少代謝負擔，限制多余副產(chǎn)物的形成，已成為合成和生產(chǎn)生物活性化合物的替代方法[20]。此外，由于天然微生物群落的復雜性，合成微生物群落可以隨時間單獨測量每種基因型的生長和代謝特性，因此通常更適用于數(shù)學建模[21]。

Chen等[22]在大米培養(yǎng)基上將土曲霉Aspergillusterreus與枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis或蠟質芽孢桿菌Bacilluscereus共培養(yǎng)，與單一的土曲霉培養(yǎng)相比，其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物積累增加了34倍。Kumari & Naraian[23]將佛羅里達平菇Pleurotusflorida和立枯絲核菌Rhizoctoniasolani共培養(yǎng)，得到了比單培養(yǎng)更高的生物產(chǎn)量。海洋真菌，Emericellasp.(CNL-878)和Salinisporaarenicola(CNH-665)共培養(yǎng)，使縮酚酸肽的產(chǎn)量增加了100倍[24]。共培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于單一菌種培養(yǎng)或許是它們更為豐富的酶系統(tǒng)和生物誘導效應利用了中間代謝物，從而有利于生物量的快速增長[25]。雜色曲霉A.versicolor與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)產(chǎn)生的3,4-二氫萘醌-(2H)-1- 1- 1(1-四酮)衍生物，aspvanicin A及aspvanicin B從未從真菌或細菌單獨的培養(yǎng)物中檢測分離到。真菌-細菌共培養(yǎng)是一種誘導產(chǎn)生新的次生代謝產(chǎn)物的有效方法[26]。在放線菌Nocardiopsissp.RV163和Actinokineosporasp.EG49的共培養(yǎng)中誘導產(chǎn)生了三種在任一微生物單獨培養(yǎng)物中都未檢測到的化合物[27]。以上結果都表明，共培養(yǎng)是提高代謝產(chǎn)物含量和發(fā)現(xiàn)新的生物活性代謝物的重要潛在策略。

1.2 微生物共培養(yǎng)的固、液體系

培養(yǎng)條件會影響微生物的代謝產(chǎn)物，這促使研究人員用不同的培養(yǎng)基進行實驗以優(yōu)化代謝物的產(chǎn)生。培養(yǎng)基的可利用性取決于培養(yǎng)微生物的類型，無論在固體或液體中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件必須對共培養(yǎng)雙方都相容[10]。因此，人們可利用不同的底物類型和培養(yǎng)條件來改變微生物群落的培養(yǎng)特征。

1.2.1 固體基質上的共培養(yǎng)

在固體培養(yǎng)基上，可研究菌絲體前端的形態(tài)發(fā)生和代謝變化及其互作模式。利用真菌在固體培養(yǎng)基上的拮抗生長特征及物種的形態(tài)，可定位共培養(yǎng)微生物代謝物誘導的“化學戰(zhàn)”區(qū)域(即代謝物誘導現(xiàn)象可能發(fā)生的地方)。但在培養(yǎng)皿中進行的固體培養(yǎng)下，只能提取有限數(shù)量的代謝物，當需要分離特定代謝產(chǎn)物進行重新鑒定或生物活性研究時，這種局限非常明顯[10]。

1.2.2 液體培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基中不同種類微生物的共培養(yǎng)也被稱為混合發(fā)酵?；旌习l(fā)酵是增加天然產(chǎn)物庫的有效方法，不僅有助于發(fā)現(xiàn)新的次級代謝產(chǎn)物，還有助于激活已知的微生物生產(chǎn)力[28]。在液體培養(yǎng)中，不易明確微生物之間相互作用的方式，但可以監(jiān)測天然產(chǎn)物的誘導，如通過比濁法監(jiān)測培養(yǎng)物的生長[10]，通過高效液相監(jiān)測代謝的變化。液體環(huán)境中的共培養(yǎng)已應用于各種微生物的開發(fā)利用中[29]。

1.2.3 固、液環(huán)境下共培養(yǎng)的優(yōu)缺點

與液體培養(yǎng)相比，固體培養(yǎng)能產(chǎn)生更多數(shù)量的代謝物，也有助于觀察真菌的相互作用區(qū)域，估計增長率等。另外，在固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)構成了一種簡單、靈活且低成本的方式，在篩選真菌共培養(yǎng)中的誘導現(xiàn)象時優(yōu)于液體培養(yǎng)[30]。然而，在固體培養(yǎng)基上大規(guī)模生產(chǎn)共培養(yǎng)產(chǎn)物仍然是一個相當復雜的過程。目前，已經(jīng)開發(fā)了幾種利用固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)物的技術[31]，這些方法能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的代謝物，從而對微生物代謝產(chǎn)物進行分離，用于深入的生物活性研究。然而，如果需要升級到工業(yè)生產(chǎn)，使用純菌株和混合發(fā)酵則仍然是至關重要的。

1.3 不同分類群共培養(yǎng)體系的建立

細菌-細菌、真菌-真菌或細菌-真菌的共培養(yǎng)組合，代表了模擬生理條件的自然驅動方法[18]。科學家已成功研究了不同微生物組合的共培養(yǎng)對微生物種群生長、互作以及不同活性代謝物的影響[32]。表1列舉了其中一些成功的實例。

1.3.1 細菌-細菌的共培養(yǎng)

細菌通常以細胞種群在微生態(tài)位上形成生物膜，一個或幾個細菌物種密切相互作用并在群落中進化，以在有限的環(huán)境中利用有限的資源來確保物種存活，并得到諸如營養(yǎng)獲取、動態(tài)生長、增加抗性等優(yōu)勢[33]。細菌共培養(yǎng)能夠促使產(chǎn)生未知的次級代謝產(chǎn)物，包括許多具有抗腫瘤、抗癌、抗菌和防污特性的分子[34]。很多時候，這類細菌主要是革蘭氏陽性的鏈霉菌，它們分布于土壤、各種海藻和海洋沉積物中[35]。

1.3.2 真菌-真菌的共培養(yǎng)

真菌-真菌的共同培養(yǎng)及其誘導的天然產(chǎn)物已見報道[36]。在共培養(yǎng)中兩個彼此接近的菌絲體可以以不同的方式互作，包括共生，中性或競爭，它們也可以從一種類型轉換到另一種互作類型。當不同菌株的菌絲在互作區(qū)相遇作用時，菌絲形態(tài)的改變加強，競爭性的菌株間可形成抗衡區(qū)，常強烈著色，暗示了顯著的代謝活動，可用以尋找新的代謝物。在互作過程中發(fā)生的變化還包括細胞外酶和胞外次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，特別是酚類和醌類化合物，這意味著對“合作伙伴”的氧化應激，進而加速真菌的新陳代謝轉變?yōu)榇紊x[10,37]。

1.3.3 細菌-真菌共培養(yǎng)

細菌-真菌的共培養(yǎng)是誘導次生代謝物、激發(fā)沉默基因簇的重要途徑[15,26]。Machín-Ramírez 等[38]的實驗表明，使用真菌-細菌共培養(yǎng)體系可以增強苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene)的生物降解。幾種不同細菌與曲霉共培養(yǎng)表明，真菌-細菌共培養(yǎng)體系是一種可豐富這些真菌化學多樣性的有效工具[39](表1)。細菌與真菌共培養(yǎng)增加了真菌的生物活性，這或許與細菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有關，這些細菌化合物作為信號分子誘導真菌合成抗菌化合物以提高真菌的生存[1]。

表1 一些共培養(yǎng)微生物組合及其誘導產(chǎn)生的重要生物活性化合物Table 1 Some co-cultured microbial combinations and important bioactive compounds induced by them

續(xù)表1(Continued Tab.1)

類型Genre共培養(yǎng)組合Microorganism usedin the co-culture培養(yǎng)基形態(tài)Culture medium誘導的新化合物New compound induced by co-culturing參考文獻ReferenceTrichophyton rubrum &Bionectriaochroleuca固體Solid medium4″-hydroxysulfoxy-2,2″-dimethylthielavin P9Phomopsis sp.K38 & Alternaria sp.E33液體Liquid mediumCyclo (D-Pro-L-Tyr-L-Pro-L-Tyr) (1) ,Cyclo (Gly-L-Phe-L-Pro-L-Tyr) (2)42Trametesversicolor&Ganoderma applanatum液體Liquid medium N-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)formamide, N-(4-methoxyphenyl)formamide 2-O-β-D-xylo-bioside14Camporesiasambuci FT1061&Epicoccum sorghinum FT1062液體Liquid medium11S-hydroxy-1-methoxyfusaricide (1)43細菌-真菌Bacterium-fungusEmericella(CNL-878)&Salinisporaarenicola(CNH-665)液體Liquid mediumEmericellamide A(1),Emericellamide B(2)24Streptomyces coelicol-or&Aspergillusniger液體Liquid medium (E)-2-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-phenol , (2E,4E)-3-(2-carboxy-1-hydroxyethyl)-2,4-hexadienedioxic acid 44Pestalotiopsis sp.&Bacillus sp.固體Solid mediumPestalotiolactones A(1),Pestalotiolactones B(2)45Penicilliun sp.DT-F29 &Bacillus sp.B31固體Solid mediumFumitremorgin A ,13-prenyl fumitremorgin B 46Bionectria sp.&Bacillus subtilis or Streptomyces lividans固體Solid medium1,2- dihydrophenopyrrozin(1)47Streptomyces piomogenus AS63D&Aspergillus niger ASMC5 固體Solid mediumPenicisteroid C (1)48

2 共培養(yǎng)產(chǎn)物的檢測

由于微生物提取物的復雜性，先進的分析方法是成功檢測和鑒定共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的關鍵。目前常用監(jiān)測代謝物的方法主要有以下幾種。

2.1 高效液相色譜法(HPLC)

這種方法提供了一種監(jiān)測單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)的不同色譜圖之間的變化，可容易地鑒定共培養(yǎng)液中的代謝物，以檢測代謝譜的變化[49]。

2.2 超高壓液相色譜時間質譜指紋圖(UHPLC-TOF-MS)

此法是近年來另一種檢測共培養(yǎng)代謝物的有效方法[50,51]。它能在培養(yǎng)皿水平上篩選固體培養(yǎng)基中的真菌共培養(yǎng)物，通過自動生成的峰列表，進行統(tǒng)計處理來比較共培養(yǎng)物獲得的LC-MS數(shù)據(jù)及其相應的單一培養(yǎng)物，突出真菌互作高表達的代謝物[30]。Bertrand等證明，這種方法可有效檢測到幾十種誘導代謝物[9]。Schroeckh等利用UHPLC-TOF-MS證明了通過真菌共培養(yǎng)可以誘導已知化合物的新硫酸化類似物[52]。

2.3 液相色譜/質譜(LC-MS)法

通常從培養(yǎng)基中提取天然產(chǎn)物，隨后進行液相色譜-質譜(LC-MS)分析以純化和分離潛在的新次級代謝產(chǎn)物，再利用核磁共振(NMR)技術對結構進行分析[19]。其它一些研究者也用這種方法發(fā)現(xiàn)和鑒定了通過共培養(yǎng)產(chǎn)生的多種活性物質[14]。

2.4 核磁共振(NMR)

此方法是代謝組學研究中應用的另一種主要分析技術，是結構鑒定的首選方法[53]。在利用核磁技術時，不需要進行樣品分離或制備，且是非破壞性的，具有很強的追蹤代謝途徑的能力，能夠明確鑒定未知代謝物的結構，在識別復雜混合物中的分子方面特別有效，因此有助于群落新陳代謝的直接生化分析[54]。Bertrand等[9]通過NMR技術成功鑒定了共培養(yǎng)的誘導物來源及新化合物的結構。

當能夠直接觀察到代謝物誘導現(xiàn)象時，可用前述簡單的高效液相色譜(HPLC)；如果沒觀察到顯著的代謝物變化時，則需要利用高級數(shù)據(jù)挖掘的敏感代謝組學方法[10]。代謝組學被定義為一種非選擇性，普遍適用的綜合分析方法。該研究領域致力于獲得完整的代謝物指紋，檢測代謝物之間的差異并產(chǎn)生假設來解釋這些差異[19,55]。此外，使用代謝組學分析可以快速鑒定在真菌-真菌相互作用過程中產(chǎn)生的新化合物[4]。而這些數(shù)據(jù)分析可以利用一些有利的工具進行，如MultiGeneBlast(用于手動挖掘基因組)[56]，PubChem數(shù)據(jù)庫(專注于化合物的數(shù)據(jù)庫)[57]，GNP / iSNAP網(wǎng)絡應用程序(用于天然產(chǎn)物鑒定的代謝組學工具)[58]，SMBP(用于基于代謝組學的次級代謝研究，可在http://www.secondarymetabolites.org上公開獲取)[59]，Mminte(用于預測微生物間發(fā)生的相互作用類型，可在www.github.com/mendessoares/MMinte上公開獲取)[60]等。此外，共培養(yǎng)產(chǎn)物的分析也是一項重大的有挑戰(zhàn)性的工作，它可通過使用多種提取方法[61]和互補的復雜分析平臺[62]，對產(chǎn)生的結構信息與復雜混合物中代謝物的鑒定進行比較[63]。

3 微生物群落的共培養(yǎng)應用

通過共同培養(yǎng)多種微生物而促進天然產(chǎn)物形成的研究表明，共培養(yǎng)是一種可促進生物活性代謝物形成的(在單一培養(yǎng)中不存在)極有前途的方法[64]。微生物組和功能菌群的研究推動了基礎研究向實際應用的轉化，具有巨大的應用潛力，并獲得了一些創(chuàng)新性的進展。表2總結了近年來共培養(yǎng)在工業(yè)、生態(tài)等領域的應用實例。

表2 不同微生物共培養(yǎng)組合的成功應用實例Table 2 Successful application examples of different microbial co-culture combinations

4 結論

微生物群落的共培養(yǎng)已成為誘導沉默的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的一種強有力的方法[73,74]。對于合成微生物群落共培養(yǎng)，在今后研究中需要關注如下幾個問題。

首先，合成微生物群落，通過改變細胞間交流、物種代謝作用以及空間結構等方式進行調(diào)控，實現(xiàn)極為精細的合作分工。為了更深入地了解微生物共培養(yǎng)的分子機制，可以利用宏基因組方法，從菌群基因組水平解析微生物群落組成及代謝調(diào)控多樣性。

其次，在微生物共培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量相對較少，因此開發(fā)分析工具變得越來越重要。將代謝分析工具和代謝網(wǎng)絡優(yōu)化工具轉化為共培養(yǎng)應用程序，促進未知代謝物的鑒定，開發(fā)衍生化合物的共享數(shù)據(jù)庫是我們進一步理解微生物間互作的重要環(huán)節(jié)[75]。

共培養(yǎng)與生物轉化的結合也十分重要。微生物轉化法是通過微生物整體細胞或產(chǎn)生的酶將復雜的底物進行結構修飾和改造，其本質在于利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物(或外源化合物)進行催化反應，使一種化合物轉變成更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物?；钚蕴烊划a(chǎn)物的生物轉化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有較強的生物活性和較低的毒性[76]。除了共培養(yǎng)產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物外，生物轉化大大增加了發(fā)現(xiàn)新化合物的概率，這為藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的思路和途徑[43]。本實驗室利用靈芝菌-蛹蟲草共培養(yǎng)發(fā)酵太子參的實驗中發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)的過程中，蟲草素的含量高于單菌發(fā)酵，說明在共培養(yǎng)的過程中會促進某些次級代謝產(chǎn)物的形成，導致現(xiàn)有天然產(chǎn)物積累的增加。