林江波，王偉英，鄒暉，戴藝民

基于轉(zhuǎn)錄組測序的鐵皮石斛植物甾醇生物合成相關(guān)基因分析

林江波，王偉英，鄒暉，戴藝民*

(福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

為了解鐵皮石斛()植物甾醇的生物合成途徑，利用Illumina HiSeq 4000高通量測序技術(shù)對莖和葉進行轉(zhuǎn)錄組測序，比較植物甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因的表達。結(jié)果表明，共獲得43 085條Unigenes，其中24 459條在Nr、Swiss-prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋，7 333條獲得共同注釋。KEGG代謝途徑分析表明，鐵皮石斛植物甾醇生物合成分為3個階段，共有50個Unigenes (30種酶)參與。表達分析表明，和的表達量明顯高于和；成熟期莖、葉的表達量比生長期高，則生長期高于成熟期；同一時期，和在葉的表達量都比莖高。這為鐵皮石斛植物甾醇的開發(fā)利用和調(diào)控植物甾醇生物合成研究提供了科學依據(jù)。

鐵皮石斛；高通量測序；植物甾醇；基因; 表達；代謝

植物甾醇不僅是生物膜的重要組成成分，還是一類無色無味的甾體類活性成分，不溶于水，溶于有機溶劑，屬于三萜類化合物，含有28~29個C原子，主要骨架是4個環(huán)的環(huán)戊烷多氫菲，C-3羥基是活性基團[1-2]，與羧酸形成植物甾醇酯，具有更好的水溶性和生理活性。植物甾醇以游離或結(jié)合甾醇的方式廣泛存在于植物體中，除常見的豆甾醇、-谷甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇外，已經(jīng)報道了超過250種的衍生物，如甾體皂苷、甾體糖苷生物堿、植物甾酮和油菜素內(nèi)酯等[3]。植物甾醇不僅具有抗氧化和延緩衰老的功能[4-5]，還對多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有預(yù)防和治療作用[6-9]。

鐵皮石斛()是蘭科(Orchi- daceae)石斛屬多年生藥食兩用植物，具有增強免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗氧化和抗疲勞等生理活性[10-11]。鐵皮石斛有效成分種類多樣，除了石斛類多糖和生物堿外，還有菲類、芪類、笏酮類、倍半萜類、甾體類及香豆素等[12]。楊柳等[13]利用正己烷蒸餾法提取的鐵皮石斛干燥莖揮發(fā)性成分中含有22,23-二氫豆甾醇、-谷甾醇、豆甾醇和油菜甾醇,相對含量分別為11.093%、4.126%、3.138%和1.648%,4種甾醇占揮發(fā)性成分的20.005%。陳曉梅等[14]從固體培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖甲醇提取物中分離鑒定到豆甾醇和-谷甾醇。仝晶晶等[15]分析了6個產(chǎn)地鐵皮石斛干燥莖的豆甾醇和-谷甾醇含量，產(chǎn)于云南省普洱市景谷縣的豆甾醇含量最高，為86.399g g-1, 產(chǎn)于浙江省樂清市雙峰鄉(xiāng)的-谷甾醇含量最高，為344.683g g-1。

轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)測序能夠獲取植物特定組織或器官在特定時期的基因表達信息，有利于挖掘藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控關(guān)鍵酶基因。吳超等[16]對鐵皮石斛葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG注釋結(jié)果表明有1 006個Unigenes與次生代謝物的生物合成有關(guān)。Guo等[17]對鐵皮石斛莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，有69個Unigenes參與生物堿骨架的生物合成。Zhang等[18]對鐵皮石斛生長期和成熟期進行轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG注釋結(jié)果表明有430個糖基轉(zhuǎn)移酶，89個纖維素合酶，135個Unigenes參與果糖和甘露糖代謝。

本研究以2個生長階段的鐵皮石斛莖、葉為材料，利用Illumina HiSeq 4000高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，以期獲得與植物甾醇合成相關(guān)的基因信息，分析鐵皮石斛植物甾醇代謝途徑, 為鐵皮石斛植物甾醇的代謝調(diào)控研究提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

鐵皮石斛()原種采自福建省龍巖市連城縣冠豸山崖壁，經(jīng)過莖段擴繁后種植于福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所資源圃，分別于生長期(2016年8月15日)和成熟期(2016年12月15日)隨機采集3株新鮮莖、葉，分別標記為T1 (生長期莖)、T2 (生長期葉)、T3 (成熟期莖)和T4 (成熟期葉)，經(jīng)液氮速凍后用干冰寄到廣州基迪奧生物科技有限公司進行RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序和Unigene功能注釋。

1.2 植物甾醇生物合成途徑分析

依據(jù)植物甾醇生物合成途徑，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GO功能分類結(jié)果，分析植物甾醇生物合成途徑的相關(guān)Unigenes。

1.3 植物甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因表達分析

用標準化后的Reads Per Kilobase per Million mapped reads (RPKM)值來表示樣品的表達量，分析植物甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因在鐵皮石斛不同生育期的表達模式。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)組裝

鐵皮石斛4個樣品的原始數(shù)據(jù)(NCBI SRA號:SRP181716)經(jīng)過濾除雜處理后，分別獲得22 809 182、19 492 544、21 587 660和21 058 784 reads，分別包含有3 388 594 751、2 884 066 418、3 171 710 203和3 132 109 020個核苷酸序列信息。將獲得的高質(zhì)量核苷酸序列進行拼接，共獲得長度大于200 bp的Unigenes片段43 085條，N50為1 628 bp，平均長度902 bp，最長Unigene片段為20 526 bp, 長度在200~299 bp的片段最多，有13 280條，其次是300~399 bp，有5 558條，≥3 000 bp的有1 701條(圖1)。

通過BLAST比對和ESTscan預(yù)測Unigene片段的編碼區(qū)(CDS)，結(jié)果表明, 有25 928條Unigenes片段含有CDS (分別獲得24 266和1 662條)，占Unigenes片段的60.18%，其中CDS長度大于1 000 bp的Unigenes片段有7 550條，占總數(shù)的17.52% (圖2)。

2.2 基因功能注釋和分類

將43 085條Unigenes片段在Nr、Swiss-prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫搜索比對序列相似性，共有24 459條獲得注釋，占總數(shù)56.77%：其中，在Nr數(shù)據(jù)庫注釋的有23 460條，占54.45%，Swiss-prot數(shù)據(jù)庫有18 514條，占42.97%；KOG數(shù)據(jù)庫有15 522條，占36.03%；KEGG數(shù)據(jù)庫有8 972條, 占20.82%；在4個數(shù)據(jù)庫都得到注釋的有7 333條, 占17.02%。

圖1 Unigene長度分布

圖2 CDS長度分布

通過GO功能數(shù)據(jù)庫比對分析，共有13 710條Unigenes得到注釋和功能分類，分為3大類49個功能(表1)，生物過程含20個功能，涉及31 519條Unigenes，其中代謝過程和細胞過程分別涉及7 617和7 200條；細胞組分含17個功能，涉及24 983條Unigenes，其中細胞和細胞組份分別涉及6 008和6 006條；分子功能含12個功能，涉及14 948條Unigenes，其中，催化活性有6 967條，結(jié)合的有6 448條。

KEGG注釋的8 972條Unigenes中有7 890條獲得Pathway注釋(表2)，分為5大類19條代謝途徑。遺傳信息處理含有4條代謝途徑，其中翻譯的Unigenes數(shù)最多，為929條；環(huán)境信息處理含有信號轉(zhuǎn)導和膜運輸2條代謝途徑；細胞過程和有機系統(tǒng)各含有1條代謝途徑；代謝含有11條代謝途徑，以碳水化合物代謝最多，1 118條。

表1 鐵皮石斛Unigene GO功能分類

表2 KEGG注釋的代謝途徑

2.3 植物甾醇生物合成途徑

KEGG注釋結(jié)果表明，共有50個Unigenes (30種酶)參與鐵皮石斛植物甾醇的生物合成(表3)。植物甾醇生物合成途徑可分為萜類化合物骨架生物合成、倍半萜類和三萜類生物合成和甾族化合物合成3條代謝途徑。

根據(jù)Pathway分析結(jié)果預(yù)測鐵皮石斛植物甾醇生物合成路徑(圖3), 萜類化合物骨架生物合成有甲羥戊酸途徑(MVA)和丙酮酸途徑(DEP)兩種，MVA途徑從乙酰CoA到生成法尼基焦磷酸共7步7個酶(10個Unigenes)參與；DEP途徑從丙酮酸和甘油醛- 3-磷酸到生成法尼基焦磷酸共11步10個酶(15個Unigenes)參與。倍半萜類和三萜類生物合成從法尼基焦磷酸到2,3-氧化鯊烯共3步2個酶(4個Unigenes)參與。甾族化合物生物合成從2,3-氧化鯊烯到菜仔甾醇和豆甾醇生成共16步12個酶(22個Unigenes)參與。

表3 KEGG注釋的鐵皮石斛植物甾醇生物合成相關(guān)的Unigene數(shù)量

續(xù)表(Continued)

2.4 植物甾醇生物合成相關(guān)酶基因表達分析

選擇、、、、、和等7種關(guān)鍵酶基因，采用RPKM值分析他們在鐵皮石斛生長期和成熟期莖、葉中的表達量。從圖4可以看出，MVA途徑的和表達量比DEP途徑的和表達量低。在生長期和成熟期的表達量差異不大，但在莖的表達量比葉片稍高。在成熟期莖、葉的表達量比生長期莖、葉高，則生長期表達量高于成熟期；同一時期，和在葉片表達量都比莖高。

3 結(jié)論和討論

本研究通過Illumina HiSeq 4000測序平臺對鐵皮石斛2個生育期的莖、葉進行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過拼接后獲得43 085條大于200 bp的Unigenes片段，其中24 459條在Nr、Swiss-prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，鐵皮石斛植物甾醇生物合成分成3個階段，共有50個Unigenes (30種酶)參與。

植物甾醇合成第一階段是法尼基焦磷酸的合成，有MVA和DEP兩種途徑。通過比較兩種途徑的2個關(guān)鍵酶基因的RPKM值，DEP途徑的和表達明顯高于MVA途徑的和，說明鐵皮石斛合成法尼基焦磷酸存在兩種途徑，但DEP途徑強于MVA途徑，這可能與鐵皮石斛是兼性景天酸途徑植物[19]有關(guān)。

植物甾醇根據(jù)側(cè)鏈C-24位上烷基分為甲基甾醇和乙基甾醇，通過甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)在C-24位上分別通過1次和2次增加甲基的步驟完成[20-21]。SMT1把1個甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAT)轉(zhuǎn)移到環(huán)阿屯醇的C-24位上，形成C-24甲烯基環(huán)阿屯醇；SMT2則催化在C-24甲烯基環(huán)阿屯醇的衍生物24-亞甲基膽甾烯醇的C-24甲基上再添加1個甲基，形成乙基甾醇[22-23]，因此，SMT1是甲基甾醇和乙基甾醇合成限速酶，SMT2是乙基甾醇合成限速酶。在煙草植株中過表達，菜油甾醇和谷甾醇分別提高80%和50%，而環(huán)阿屯醇和膽固醇含量分別下降53%和34%。過表達顯著降低了膽固醇和C-24甲基甾醇含量，而谷甾醇含量顯著提高[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)相同生育期鐵皮石斛的和在葉片中的表達量都明顯高于莖，推測葉片中植物甾醇的合成比莖高。8月份的葉表達量明顯高于，12月份則相反, 推測8月份葉片合成乙基甾醇多，而12月份則合成甲基甾醇多，這有待于對鐵皮石斛和功能的進一步鑒定，分析不同生長階段植物甾醇組分和含量。

圖3 鐵皮石斛植物甾醇生物合成途徑

圖4 鐵皮石斛7個植物甾醇生物合成相關(guān)基因的表達模式。T1: 生長期莖; T2: 生長期葉; T3: 成熟期莖; T4: 成熟期葉。

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Analysis of Related Genes in Phytosterol Biosynthesis inBased on Transcriptome Sequencing Technology

LIN Jiang-bo, WANG Wei-ying, ZOU Hui, DAI Yi-min*

(Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian, China)

In order to understand the biosynthetic pathway of phytosterol in, the transcriptome sequence of stems and leaves at two growth stages was analyzed by using Illumina HiSeq 4000 high-throughput sequencing method, and the expressions of key enzyme genes for phytosterois synthesis were compared. The results showed that a total of 43 085 Unigenes were obtained by transcriptome sequencing, of which 24 459 Unigeneswere annotated in Nr, Swiss-prot, KOG and KEGG databases, and 7 333 were commonly annotated. KEGG metabolic pathway analysis showed that phytosterol biosynthesis ofcould be divided into three stages with 50 Unigenes (30 enzymes) involved. The expressions ofandwere significantly higher in stems and leaves than that ofand. The expression ofat mature stage was higher than that at growth stage, while the expression ofwas the opposite. The expressions ofandwere higher in leaves than that in stems at the same stage. These would be lay a foundation for the development and utilization of phytosterol and regulating phytosterol biosynthesis in.

; High-throughput sequencing; Phytosterol; Gene; Expression; Metabolism

10.11926/jtsb.4025

2018-12-03

2019-03-04

福建省自然科學基金面上項目(2018J01119)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Grant No. 2018J01119).

林江波(1976~ )，男，碩士，副研究員，從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。E-mail: 345953257@qq.com

Corresponding author. E-mail: dymttcn@163.com