朱弘, 蔡厚才, 李涌福, 陳萬東, 陳林, 伊賢貴, 李蒙, 段一凡*, 王賢榮*

中國東部沿海水仙歸化群體的遺傳多樣性

朱弘1, 蔡厚才2, 李涌福1, 陳萬東2, 陳林1, 伊賢貴1, 李蒙1, 段一凡1*, 王賢榮1*

(1. 南京林業(yè)大學南方現代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學院，亞熱帶森林生物多樣性保護國家林業(yè)局重點實驗室，南京 210037；2. 南麂列島國家級海洋自然保護區(qū)管理局，浙江 溫州 325400)

為揭示我國東部歸化水仙(var.)的群體遺傳多樣性，利用2個葉綠體基因K和HA片段對采自滬、浙、閩的5個代表群體的49株水仙進行了評估。結果表明，雙基因聯合序列的總長為1 443 bp，共定義6個單倍型，各歸化群體的遺傳多樣性水平為DLSY>PTD>NJD=ZZ>CMD。AMOVA分析表明，群體內變異為遺傳變異的主要來源(91.98%)，群體間的遺傳分化較低(F=0.08022)。群體物種水平上的譜系結構不顯著(N=0.020<G=0.031;< 0.05)。Mantel檢驗表明水仙群體間的遺傳距離與地理距離呈顯著的線性相關(=0.929，=0.02<0.05)。中性檢驗和錯配分布分析結果均暗示水仙群體背離了快速擴張模型的假設。單倍型分布的中介網絡圖結合系統(tǒng)發(fā)育NJ樹均將所有群體劃分為2大分支。因此，我國東部沿海水仙歸化群體整體遺傳多樣性水平較低，各群體間遺傳分化較弱，遺傳變異主要來自群體內,物種近期未經歷擴張事件，可能是基因流受海島隔離、自身生物學特征、生境異質性與及人為干擾的綜合作用影響。

水仙；中國東部沿海；歸化群體；葉綠體DNA；遺傳結構

水仙(var.)為石蒜科(Amaryllidaceae)多年生鱗莖植物，是歐洲水仙()的變種，也是世界著名觀賞花卉和中國傳統(tǒng)十大名花之一，以其獨特的形態(tài)和香氣為世人所熟知。史籍考證與植物學證據表明該變種系地中海沿岸起源，主要歸化分布于亞洲東部沿海地區(qū)或近海島嶼[1]，在我國栽培歷史悠久，具有重要的觀賞、經濟與文化價值。隨著對水仙種質資源數量與質量需求的日益提高，前人已在抗性生理[2-3]、矮化機理[4]、組培擴繁[5]、功能基因[6]等方面取得了一系列的研究。

掌握植物遺傳多樣性格局，是開展資源保護與利用的前提基礎。探究植物群體遺傳結構在時間和空間上的遺傳變異特征及分布格局，在反映物種進化歷史、生境適應等方面具有重要作用[7-9]。群體研究主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學和現代分子標記2種手段,分子標記具有不受環(huán)境或植株發(fā)育階段影響、規(guī)避測量誤差、可重復性高等優(yōu)勢。近10年來，隨著分子生物學發(fā)展，國內外有關水仙屬遺傳多樣性的研究，已由早期的AFLP、ISSR、RAPD等標記類型[10-11]逐漸過渡到DNA測序。其中，基于葉綠體DNA (cpDNA)標記和序列分析具有不受選擇影響、多態(tài)性豐富等優(yōu)點；同時，大多數被子植物cpDNA為母系遺傳，比雙親遺傳的nrDNA在亞種群間表現出更大的遺傳分化，能產生更清晰的種群歷史蹤跡[12]，因此，當前cpDNA標記已成為研究植物群體遺傳與譜系地理的主流手段之一，廣泛應用于植物種間較低分類階元和種內譜系地理學研究。

在野外調查中，筆者發(fā)現當前我國水仙歸化地普遍存在生境片斷化嚴重、種群規(guī)模和數量銳減等問題，有關其在區(qū)域尺度上的遺傳多樣性現狀尚未報道。鑒于此，本研究采用2個水仙高變區(qū)的cpDNA標記，首次對我國水仙集中分布的東部沿海地區(qū)的5個主要歸化群體的序列變異進行分析，旨在了解以水仙歸化群體為代表的海島植物地理隔絕狀態(tài)下的群體遺傳多樣性水平，以及分布格局的可能形成機制，以期為海島特色種質資源的科學評價、合理保護與經營利用提供分子遺傳學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

2017年冬季，個體樣本自北向南分別采自上海、浙江、福建的5個歸化水仙代表群體，覆蓋了水仙在中國東部沿海的主要分布區(qū)，共計49個樣本，記錄樣品編號、采集地點、經緯度、花型等基本信息(表1), 其中平潭島(PTD)重瓣水仙為逸生的栽培品種‘玉玲瓏’。群體內個體的采集距離至少相隔10 m以上，選擇當年生新發(fā)的幼嫩葉片經變色硅膠干燥處理后，置于-20℃冰箱備用。活體材料引種至南京中山植物園，憑證標本存于南京林業(yè)大學樹木標本館(NF)。

1.2 基因組DNA提取和PCR擴增

植物基因組DNA采用柱式抽提純化法試劑盒(Tiangen, 北京)提取, 用1%瓊脂糖凝膠電泳和Tanon-2500全自動數碼凝膠圖像分析儀(Tanon, 上海)檢測DNA質量。參考已報道的水仙屬候選DNA條碼[13]進行篩選，預試驗結果表明，水仙cpDNA編碼區(qū)的K (F: 5?-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3?, R: 5?-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3?)與非編碼區(qū)的H-A (F: 5?-GTTATGCATGAACGTAA- TGCTC-3?，R: 5?-CGCGCATGGTGGATTCACAAT- CC-3?)正反向引物片段在種內群體水平表現出較高的變異，且測序成功率最高，故選擇上述序列進行研究。PCR擴增體系總體積為25L: 包含2×PCR MasterMix (TsingKe, 南京) 12.5L, 上下游引物各1.0L (GenScript, 南京)，DNA模板2.0L, 最后用ddH2O 8.5L補齊。K的PCR擴增程序為94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，41℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min；H-A的PCR擴增程序為94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，47℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至南京金斯瑞生物科技公司進行純化與測序，樣本基于ABI 3730XL測序平臺進行正向測序。

表1 5個水仙歸化群體的采集信息

1.3 數據分析

將獲得的單基因序列分別在BioEditor 7.0.9軟件[14]中的ClustalW模塊進行聯配與手工校正。使用SequenceMatrix 1.7.8軟件包[15]進行雙基因序列的拼接。利用DNASP 5.10.1軟件[16]進行聯合序列的特征分析，包括統(tǒng)計單倍型(haplotype)數量()、平均核苷酸差異數(average number of nucleotide,)、單倍型多樣性(haplotype diversity,d)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,)、遺傳分化系數(G)、基因流(N)等遺傳多樣性指數以及種群歷史動態(tài)的中性檢驗(neutrality test)和失配分析(mismatch distribution), 群體間基因流采用N=(1/G-1)/2[20]進行估算。使用Arlequin 3.1軟件[17]進行分子方差分析以判別變異的來源。使用PermutCpSSR 2.0軟件包(http://www. pierroton.inra.fr/genetics/labo/Software/Permut/)中的U統(tǒng)計法檢驗(1 000次重復置換)比較遺傳分化系數G和N,以檢驗水仙是否存在譜系地理結構。使用GenAlEx 6.503軟件包[18]在Microsoft Excel 2007中進行Mantal檢驗，分析水仙群體遺傳距離與地理距離是否存在地理隔離(isolation by distance, IBD)作用。在Network 5.0.1.0軟件(http://www.fluxus- engineering.com/sharenet.htm/)中基于最大簡約性原則的中介鄰接網絡法(median-joining network, MJ)獲得單倍型中介網絡圖，并在Adibe Illustrator CS6軟件中進行優(yōu)化布局與重新繪制。并利用MEGA 5.0軟件[19]構建以鄰接法(neighbor-joining, NJ)為算法的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹, 并采用bootstrap法(1 000次重復置換)以檢驗聚類樹各分支置信度。

2 結果和分析

2.1 序列變異與單倍型分布

兩個cpDNA片段拼接后的序列總長度為1 443 bp,G+C含量為33.10%，共檢測出8個變異位點(7個簡約信息位點和1個自裔位點)；共定義了6個單倍型(haplotypes, Hap1~Hap6)，其中K對應的變異位點為673、767、801、807和809，H-A對應的變異位點為906、1 333和1 383。根據溯祖理論, 貢獻單倍型(Hap2)位于單倍型中介網絡中心, 應為5個地理群體的共有古老單倍型，而私自有單倍型則分散在各個群體，應為近期輻射分化出來的年輕單倍型(圖1, 表2)。

2.2 遺傳多樣性評估

從表3可見，群體的總體單倍型多樣性(d)為0.363±0.086，核苷酸多樣性()為0.000 49±0.000 19；按遺傳多樣性水平，5個水仙歸化群體依次為大檑山嶼(DLSY)>平潭島(PTD)>南麂島(NJD)=漳州(ZZ)>崇明島(CMD)。

2.3 群體遺傳結構與分化

從表4可見，兩兩群體間的基因流較強, 且所有群體間的基因流都>4；分子方差分析(AMOVA) 結果表明，群體內變異占了總變異的91.98%，為遺傳變異的主要來源；固定指數(F)為0.080 22，群體間的遺傳分化較弱(表5)；通過1 000次重復計算獲得的群體遺傳分化系數(N=0.020<G=0.031;<0.05), 表明水仙在物種水平上不具有明顯的譜系結構。

圖1 中國東部沿海5個水仙歸化居群的葉綠體單倍型分布

表2 基于葉綠體matK+trnH-psbA序列的水仙6個單倍型中的變異位點

*: 該堿基變異位點與Hap1相同。

*: Variation site of the base is the same as Hap1.

表3 5個水仙歸化群體的遺傳多樣性

表4 5個水仙歸化群體間的遺傳分化系數(Gst, 對角線下)及基因流(Nm, 對角線上)

水仙歸化群體間的遺傳距離(G)與地理距離(K, 自然對數轉化)矩陣的Mantel檢驗結果表明,兩者之間具有顯著的線性關系(=0.929,=0.02< 0.05) (圖2)。

2.4 群體擴張事件檢測

選擇中性檢驗和失配分析推測水仙群體的擴張事件。通常用Tajima的指數[21]可以反映較大時間尺度上的種群事件，而Fu的*指數[22]對近期的事件比較敏感。本研究結果表明，中性檢驗均無顯著性意義(D=-0.165 395,>0.05;*=0.590 83,> 0.10)。同時，錯配分布分析(MDA)中，觀測值與期望值比較得到的雙峰曲線結果也表明水仙群體背離了快速擴張模型的假設，即群體在進化過程中未經歷過快速擴張(圖3)。

表5 5個水仙歸化群體的分子方差(AMOVA)分析

圖2 水仙歸化群體遺傳距離與地理距離的Mantel檢測

圖3 水仙49個個體錯配分布分析

Fig. 3 Mismatch distribution analysis for 49 individuals ofvar.

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)育關系

基于遺傳距離鄰接法構建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可知，與中介網絡圖結果一致(圖1)，水仙6個單倍型明顯被劃分為2個譜系分支，Hap4與Hap5聚為一大支，其余單倍型聚為另一大支，靴帶支持率(bootstrap)分別為80%和88%。其中Hap1、Hap3與Hap2又單獨聚為一小支, 從而表現出更近的親緣關系。

3 討論

開展遺傳變異分析有助于評價物種的進化潛力與環(huán)境適應能力，也是開展保護生物學研究的核心[23-25]?；赾pDNA序列變異的結果，從整體上看, 我國歸化水仙的遺傳多樣性水平較低，這與前人應用RAPD等其他標記手段的研究結果一致[10]; Mantel檢測的相關系數較高且達到顯著水平(= 0.929,<0.05)，符合地理隔離IBD模型，歸化群體遺傳距離更受地理距離影響顯著，表明海島間的地理隔離已經成為該種基因流擴散的主要屏障。細胞染色體研究表明，中國水仙主要為同源三倍體[26],在自然狀況下水仙只能采取以母鱗莖為中心的側球無性繁殖方式，大多呈聚集分布，缺乏長距離的傳播機制[27]，使得居群內交流遠大于居群間。本研究中的分子方差分析結果亦顯示水仙群體變異主要來源于種群內(91.98%)。此外，水仙棲息地嚴酷生境尤其是土壤的貧瘠及基鹽脅迫無疑降低了水仙種群的生態(tài)適應性，而其物候花期寒冷的氣溫與強烈的海風等因素或可導致長距離的傳粉者缺失, 奠基者效應的出現大大降低了群體遺傳多樣性。

圖4 水仙6個單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹。分支上數值為1 000次重復得到的靴帶支持率。

植物在長期的遷移演化過程中為適應不同生境形成了不同的地理生態(tài)類群，生態(tài)隔離(isolation by ecology, IBE)作用往往可以加速物種的遺傳分化[28]。前人的研究均表明歸化水仙在我國存在一定的遺傳變異特征[29]，陳曉慧等[30]基于居群統(tǒng)計，分析比較了我國沿海4個島嶼8個群體的形態(tài)學特征差異, 認為南麂產的水仙具有植株小、花朵大的特點，是一種珍稀遺傳資源。而結合本文的cpDNA單倍型分布來看(圖1)，各群體均含有1個以上的私有單倍型，暗示我國沿海島嶼的環(huán)境異質性較高，水仙居群可能存在局域適應(local adaptation)現象；水仙屬植物通常性喜溫暖、濕潤及沙質土壤，在我國東部歸化群體中，大檑山嶼(DLSY)含有2個私有單倍型導致其遺傳多樣性綜合排序第一，這可能是由于其地處南麂列島國家級自然保護區(qū)核心區(qū)的地理優(yōu)勢，在區(qū)系劃分上屬于華東植物區(qū)系南北過渡特征，亞熱帶海洋性季風區(qū)及臺灣暖流帶來的水熱氣候條件相對充沛[31]；基于群落生態(tài)學研究亦表明,大檑山嶼具有適宜水仙生長的排水較好、土壤鹽分適中與溫度適宜的微生境[27]，可能使得大檑山嶼群體產生了適應性分化。有意思的是，該群體與緊鄰的南麂島(NJD)共享一個單倍型(Hap3)，且基因流(N=12.000)最高、遺傳分化(G=0.040)最小，相較其它群體而言顯示出最近的親緣關系；而雖然在物種水平上遺傳多樣性較低，但水仙各群體間的平均基因流均>4，說明群體間的基因流持續(xù)發(fā)生(表5)，結合單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析，聚類結果也與地理距離不一致(圖4)。根據實際調查走訪得知，造成上述現象很可能與歷史上海島漁民人為多次移栽事件密切相關，即群體間可能經常性交換遷徙個體; cpDNA單倍型中介網絡圖還顯示，平潭島(PTD)與其余群體的親緣關系相對最遠，該群體是歸化水仙中為數不多的重瓣類型‘玉玲瓏’，其副花冠和雄蕊花瓣狀，黃白相間，與大部分單瓣、純白花色類型截然不同[32],有關其花色及花形變異的生理與分子機制還有待進一步研究，但無疑反映了人類經濟活動,對水仙遺傳分布格局帶來的持續(xù)影響。

目前在我國水仙市場上，栽培品種中除了‘玉玲瓏’，還有‘金三角’、‘金邊’和‘云香’等，但都分布不均，栽培面積極少且產地不明，品種類群十分單一；而且由于水仙很難通過有性繁殖同其他物種進行雜交獲得新的基因，長期的無性繁殖，勢必導致種群衰退、品質降低等問題，這將嚴重制約水仙花卉產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[33]。因此，開展我國歸化水仙資源種群動態(tài)和遺傳變異的研究進而獲得基礎的遺傳學背景信息是非常必要的。本研究綜合利用了植物分子譜系地理學的方法，首次對我國東部沿海水仙5個代表歸化群體49個樣本進行遺傳多樣性檢測及分析，初步闡明了該物種在區(qū)域尺度上的遺傳多樣性水平與空間分布，這無疑有助于下一步水仙衰退種群的恢復保育工作的開展。同樣以南麂島產水仙尤其是大檑山嶼為代表，基于群體遺傳cpDNA標記的分子證據，該歸化群體應為中國東部沿海一個特殊且重要的基因型或生態(tài)型分化類群，目前雖然已經列入核心保護區(qū)，但由于靠近旅游區(qū)仍然面臨人類經濟活動的日益影響，應結合沿海島嶼特殊的生態(tài)系統(tǒng)進行綜合管理，做好持續(xù)的宣傳、保護與管理工作。短期而言，就地保護可能是最為有效的措施，可以在保護區(qū)內增加護欄、控制伴生入侵雜草及定期巡護工作；長期而言，一方面通過原地建立固定樣地，開展對種群及物候的動態(tài)監(jiān)測，另一方面通過離體培養(yǎng)、人工種苗擴繁、自然回歸試驗等措施，從而促進其種群的正向更新。同時也應發(fā)揮其重要的科學價值，將該區(qū)域優(yōu)先選為核心種質苗圃或遺傳基因庫建設的遺傳材料來源地，或可從中選擇適宜的親本以提高雜交育種效率。總之,本研究可為海島特色種質資源的綜合評價、科學保護與開發(fā)利用提供理論依據。

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Genetic Diversity ofvar.Populations in Eastern Coast of China

ZHU Hong1, CAI Hou-cai2, LI Yong-fu1, CHEN Wan-dong2, CHEN Lin1, YI Xian-gui1, LI Meng1, DUAN Yi-fan1*, WANG Xian-rong1*

(1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and the Environment, Key Laboratory of State Forestry Administration on Subtropical Forest Biodiversity Conservation,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037, China; 2. Nanji Islands National Marine Natural Reserve Administration Bureau,Wenzhou 325401, Zhejiang, China)

To reveal the genetic diversity of naturalizedvar.populations in eastern coast of China, 49 individuals from five representative populations distributed in Shanghai, Zhejiang and Fujian Proviences were evaluated by using two chloroplast DNAK andHA fragments. The results showed that total of six haplotypes were identi?ed from the combined two sequences with an alignment length of 1 443 bp. The genetic diversity of naturalized population was in order of DLSY>PTD>NJD=ZZ>CMD. AMOVA analysis showed that the variation within populations was the main source of the genetic variation (91.98%) and low genetic differentiation between populations (F=0.080 22). Insigni?cant phylogeographic structure was detected at species level (Nt=0.020<G=0.031;<0.05). Mantel test showed a significant linear correlation between genetic distance and geographical distance (=0.929,=0.02<0.05). The neutrality test combined bimodalcurve in mismatch distribution analysis both rejected the hypothesis of the demographic expansion of these populations. Analysis of median network and phylogenetic NJ tree based on the distribution of haplotype both divided all the populations into two major branches. These indicated a low level of genetic diversity with a weak genetic differentiation amongvar.populations in eastern coast of China. Genetic variation mainly occurs in populations, while species had experienced no demographic expansion. These might likely owing to the gene flows which were caused by the combination of islands segregation, biological characteristics, habitat heterogeneity as well as human disturbance.

var.;Eastern coast ofChina; Naturalized population; cpDNA; Genetic structure

10.11926/jtsb.4045

2019-01-21

2019-03-15

南麂列島國家級海洋自然保護區(qū)研究項目(NJKJ-2016-006)資助

This work was supported by the research program of Nanji Islands national marine natural reserve (Grant No. NJKJ-2016-006).

朱弘(1990~)，男，博士研究生，主要從事亞熱帶森林生態(tài)與譜系地理學研究。E-mail: 1107401987@qq.com

Corresponding author. E-mail: wangxianrong66@nifu.edu.cn; 67181278@qq.com