劉曉寧，陳 振，劉伯玉，任翠平，柳 燕

恙蟲病亦稱叢林斑疹傷寒，是恙螨叮咬人體感染恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi, O.ts)而引起的人畜共患傳染病[1]。全球50%以上人口生活在恙蟲病疫區(qū)，每年約有100萬人感染恙蟲病[2]。在我國，1985年以前恙蟲病主要在長江以南(北緯31°)地區(qū)流行[3]；1986年后在長江以北出現(xiàn)恙蟲病，證實(shí)了恙蟲病疫源地北移[4-5]。2008年秋阜陽市暴發(fā)的不明原因發(fā)熱疫情，證實(shí)為恙蟲病疫情[6-7]；Cao et al[8]于2016年報道了安徽省滁州市散發(fā)恙蟲病病例。恙蟲病極易與其他發(fā)熱性疾病相混淆，出現(xiàn)誤診誤治情況[9]。因此，收集阜陽市2015年9～11月的不明原因發(fā)熱病例標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)檢測及實(shí)驗(yàn)方法相互驗(yàn)證，對病歷資料歸納分析，以期為安徽省乃至全國恙蟲病的實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷及精準(zhǔn)用藥和有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料、血清標(biāo)本采集收集2015年9～11月阜陽市不明原因發(fā)熱疫情臨床病例資料，采集發(fā)病后6～17 d急性期血液標(biāo)本235份，發(fā)病后4個月采集恢復(fù)期血液標(biāo)本47份。

1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；pMDTM18-T載體克隆試劑盒(日本TaKaRa公司)；羊抗人IgM、羊抗人IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；Gilliam、Karp和Kato混合標(biāo)準(zhǔn)株抗原片(美國University of Texas Medical Branch惠贈)；PCR儀(德國Jena公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS TMT3-21型)。

1.3 間接免疫熒光(indirect immunofluorescence,IFA)恙蟲病IgM抗體定性檢測，血清1 ∶80稀釋；恙蟲病IgG抗體定量檢測，血清按1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320、1 ∶1 280、1 ∶5 120、1 ∶10 240、1 ∶20 480進(jìn)行梯度稀釋。血清為一抗與抗原片進(jìn)行反應(yīng)， 37 ℃、45 min，用PBS洗滌4次，每次5 min，晾干。二抗為FITC標(biāo)記羊抗人IgM和IgG，重復(fù)上述步驟，晾干后滴加90%甘油覆蓋抗原片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 巢式PCR(nested polymerase chain reaction, nested-PCR)和產(chǎn)物克隆測序急性期血標(biāo)本核酸經(jīng)nested-PCR擴(kuò)增O.ts 56-ku蛋白特異性基因片斷。外引物為 56 ku-out-f: 5′-TACATTAGCTGCGGGTATGACA- 3′和56 ku-out-r: 5′-CCAGCATAATTCTTCAACCAAG- 3′；內(nèi)引物為56 ku-in-f：5′-GAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA- 3′和56ku-in-r：5′-TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG- 3′[6]。反應(yīng)條件為95 ℃、 5 min，1個循環(huán)；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35個循環(huán)；72 ℃、10 min，1個循環(huán)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接到T載體中以構(gòu)建DNA重組質(zhì)粒。氨芐抗性LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，藍(lán)白篩選重組質(zhì)粒，細(xì)菌搖瓶培養(yǎng)后送GENERAL BIOSYSTEMS公司測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用描述性流行病學(xué)方法進(jìn)行分析。Epidata 3.1建立數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用Excel 2010和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1.1nested-PCR和IFA檢測結(jié)果比較 nested-PCR檢測和測序分析235例急性期血液標(biāo)本核酸陽性率為63.40%(149/235)，IFA檢測235例急性期血清IgM抗體陽性率為86.38%(203/235)；nested-PCR檢測核酸和IgM抗體檢測陽性率之間進(jìn)行配對χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種方法之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.17,P<0.05)，IgM抗體檢測陽性率高于核酸檢測(表1)。當(dāng)急性期血清IgG抗體效價≥1 ∶1 280時，抗體檢測和核酸檢測結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，OR=0.22。nested-PCR檢測核酸和IFA檢測IgG抗體陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.73,P<0.05)，即當(dāng)急性期血清IgG抗體效價<1 ∶1 280時，可同時檢測到病原和抗體；當(dāng)急性期血清IgG抗體效價≥1 ∶1 280時，nested-PCR檢測核酸的陽性率下降，雙份血清抗體檢測敏感性高于核酸檢測(表2)。

表1 235例急性期血液標(biāo)本nested-PCR和

表2 47例急性期血清的nested-PCR和IgG結(jié)果比較(例)

2.1.2雙份血清IgG抗體檢測 免疫熒光檢測47例急性期和恢復(fù)期血清恙蟲病IgG抗體，IgG抗體在發(fā)病后的第6天即被檢測到，效價達(dá)到1 ∶80；隨著時間的推移，抗體效價逐漸增加，其變化趨勢如(圖1)。76.60%(36例)的急性期IgG抗體的效價集中在1 ∶320～1 ∶5 120?；謴?fù)期血清抗體效價降低的35(74.46%)例，其中效價有4倍降低的17例，16倍降低的10例，64倍降低的2例；抗體效價有4倍及以上升高的6例，效價無變化的有6例，各占12.77%(表3)。78.57%(33例)恢復(fù)期效價集中在1 ∶80～1 ∶320。

2.2 一般結(jié)果人群對恙蟲病易感，40～49歲人群的發(fā)病率最高；女性有208例，占88.51%；男性有27例，占11.49%；農(nóng)民占所有患者人數(shù)的96.60%(227/235)。發(fā)病時間集中在10月11日～11月10日，呈現(xiàn)出暴發(fā)流行態(tài)勢。恙蟲病最長潛伏期為11 d，最短為4 d，平均潛伏期為(6.85±2.38)d。

圖1 IgG抗體出現(xiàn)時間和效價變化趨勢表3 IFA檢測恙蟲病患者雙份血清IgG抗體效價結(jié)果(例)

效價急性期IgG恢復(fù)期IgG4倍升高效價無變化4倍下降抗體消失恢復(fù)期IgG1 ∶8063101131 ∶320132271201 ∶1 280150212161 ∶5 1209018031 ∶20 480400310總計476630542

2.3 臨床體征

2.3.1發(fā)熱 所有病例均有發(fā)熱，平均持續(xù)(7.00±4.89)d，平均體溫(38.99±0.52) ℃。包括稽留熱3例，弛張熱8例，不規(guī)則熱224例。

2.3.2焦痂或潰瘍 235例病例中有156例(66.38%)有焦痂和潰瘍。分布在：腹股溝(21例)、腋窩(24例)、胸部或乳房(29例)、腰帶壓迫部位(31例)、腘窩(7例)、上肢(8例)、腳踝(13例)、腿部(6例)、背部(8例)、肛周(4例)、會陰部(5例)。

2.3.3其他癥狀和體征 除了發(fā)熱、焦痂或潰瘍外，頭痛195(82.98%)例，畏寒140(59.57%)例，淋巴結(jié)腫大85(36.17%)例，皮疹155(65.96%)例。

2.4 臨床檢查血常規(guī)檢查中各項(xiàng)指標(biāo)多在正常范圍內(nèi)。生化檢查中，107例(70.39%)C反應(yīng)蛋白升高，202例(85.96%)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，191例(81.62%)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高；總蛋白、白蛋白、球蛋白、總膽紅素和堿性磷酸酶多數(shù)在正常范圍內(nèi)。136例(63.85%)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高；134例(74.03%)乳酸脫氫酶升高；177例(86.76%)α-羥丁酸脫氫酶升高；74例(87.06%)肌酸激酶升高；肌酸激酶同工酶多數(shù)在正常范圍內(nèi)。

2.5 治療和預(yù)后臨床多給予阿奇霉素(500 mg/d)進(jìn)行抗感染經(jīng)驗(yàn)治療，5 d左右恢復(fù)正常，患者預(yù)后較好，治愈率達(dá)到100%。

3 討論

恙蟲病是存在于自然界中的人畜共患傳染性疾病，中國是其主要流行地區(qū)[10]。阜陽市自2008年秋季發(fā)生了一起恙蟲病疫情后[11]，每年10～12月呈現(xiàn)季節(jié)性發(fā)病。對235例2015年9～11月阜陽市不明原因發(fā)熱患者血液標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的相互驗(yàn)證分析，并統(tǒng)計歸納出阜陽恙蟲病的臨床特征，以便指導(dǎo)長江以北地區(qū)恙蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷、治療和預(yù)防工作。

nested-PCR檢測證明，阜陽市2015年秋季的不明原因發(fā)熱疫情是以恙蟲病為主的急性傳染病，核酸陽性率為63.4%，IgM抗體陽性率為86.38%，證明了免疫熒光實(shí)驗(yàn)中使用Gilliam、Karp和Kato混合抗原能夠提高恙蟲病感染的早期檢出率。核酸檢測感染早期陽性率低于IgM抗體陽性率，可能是由于樣本抗體滴度較高，導(dǎo)致病原體含量減少，且釋放到胞外的病原體少不能被檢測到。急性期IgG抗體效價≥1 ∶1 280時，nested-PCR檢測的陽性率隨恙蟲病抗體效價升高而下降。由此判斷，當(dāng)急性期患者血液恙蟲病核酸檢測為陰性時，如恙蟲病血清IgG抗體效價≥1 ∶1 280時，對恙蟲病的診斷具有輔助意義。

47份配對雙份血清中，恙蟲病IgG抗體在患者發(fā)病后6 d即可檢測到，抗體效價達(dá)1 ∶80，在發(fā)病后15～17 d達(dá)到1 ∶20 480。恙蟲病IgG抗體產(chǎn)生較早，且抗體水平增長較迅速?；謴?fù)期血樣采集于治療后4個月，有35份(74.46%)血清抗體效價有4倍以上下降甚至消失，說明感染恙蟲病東方體后機(jī)體產(chǎn)生的IgG抗體維持時間不長，4個月左右有明顯下降，甚至消失。據(jù)此，可認(rèn)為恙蟲病東方體的IgG抗體對機(jī)體的保護(hù)力及保護(hù)時間有待進(jìn)一步研究。當(dāng)然，如果是恢復(fù)期連續(xù)樣本采集和研究，會給出更好的IgG抗體升、降時間曲線。

恙蟲病發(fā)病存在職業(yè)和性別差異，農(nóng)民是恙蟲病的高危人群，且以40～69歲女性為主，這可能與阜陽市是農(nóng)民工輸出大市有關(guān)，青壯年勞動力多外出務(wù)工，鄉(xiāng)下的勞動力以中老年女性為主。暴發(fā)流行時間集中在10月11日～11月10日，與江蘇、山東等地報道[4]的恙蟲病發(fā)生時間吻合，為“秋冬季型恙蟲病”。

綜上，2015年阜陽市的不明原因發(fā)熱為“秋冬季型恙蟲病”疫情?；旌峡乖璉gM抗體檢出恙蟲病陽性率高，IgG抗體檢測可輔助nested-PCR檢測提高檢出率。人體感染恙蟲病后，機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體時間早，效價升高迅速。在發(fā)病治療后4個月后IgG抗體有較大程度降低甚至消失，說明恙蟲病IgG抗體維持時間短，推測可能為恙蟲病每年暴發(fā)流行的因素之一。