呂舸，周吉芳，楊杰，丁啟龍

(中國(guó)藥科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京 211198)

“Fork head”最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，作為一種潛在的轉(zhuǎn)錄因子，隨后證明其有翼狀DNA結(jié)合區(qū)域，此時(shí)意識(shí)到它可能是已發(fā)現(xiàn)的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如HNF-3A，即現(xiàn)在的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A1(FOXA1)[1]。它存在于所有的真核生物中，在哺乳動(dòng)物中叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族O亞族(FOXO家族)包括4個(gè)成員：FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXO6，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，F(xiàn)OXO6最晚被發(fā)現(xiàn)，在結(jié)構(gòu)和功能上和其他3個(gè)差別較大[2]。FOXO家族均有一個(gè)由110個(gè)氨基酸構(gòu)成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合到靶基因的TTGTTTAC序列，從而發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)糖異生、細(xì)胞周期停滯、分化、DNA修復(fù)，自噬和細(xì)胞凋亡等。FOXO家族不同成員有不同的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)OXO1主要調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)OXO3是無(wú)脊椎動(dòng)物、小鼠和人類中重要的調(diào)節(jié)壽命的因子，也和氧化應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤抑制活性密切相關(guān)[3]。

機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇(ROS)，ROS是電子軌道最外層有未配對(duì)電子的活性基團(tuán)，包括自由基和一些強(qiáng)活性的分子?；钚匝踹^(guò)多產(chǎn)生會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，最初被認(rèn)為是有毒的，是有氧代謝的產(chǎn)物。但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)ROS可以作為信號(hào)傳導(dǎo)的“第二信使”，在細(xì)胞信號(hào)通路中扮演重要角色，特別是在應(yīng)激反應(yīng)下，體內(nèi)ROS會(huì)產(chǎn)生變化，對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。

FOXO是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，刺激編碼抗氧化蛋白基因的表達(dá)，對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)的氧化反應(yīng)[5]。另一方面，ROS也能在多種水平調(diào)節(jié)FOXO的活性，包括轉(zhuǎn)錄后修飾和轉(zhuǎn)錄修飾[6]。本文就ROS對(duì)FOXO活性和蛋白基因表達(dá)的調(diào)節(jié)進(jìn)行綜述。

1 ROS在FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾中的作用

FOXO的活性受到多種轉(zhuǎn)錄后修飾和核質(zhì)穿梭的控制，最近FOXO合成的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)已經(jīng)成為了FOXO功能調(diào)節(jié)的一種新的方式。有證據(jù)表明FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)節(jié)方式主要用于應(yīng)答應(yīng)激刺激，包括氧化應(yīng)激[5]。FOXO是各種激酶的底物，能夠被磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化和氧化等，這些修飾能夠影響FOXO的活性，如FOXO的DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活活性、亞基定位、以及和轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合。

1.1 ROS影響FOXO蛋白的磷酸化修飾 磷酸化是FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的一種重要形式，它能夠影響FOXO的核質(zhì)穿梭和DNA結(jié)合。引起FOXO磷酸化的主要是上游信號(hào)級(jí)聯(lián),最重要的一條信號(hào)通路起始于胰島素受體和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體，通過(guò)作用于磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)，引起FOXO的磷酸化失活以及出核[7]。ROS在胰島素受體(InsR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IDF1-R)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中能夠作用于多個(gè)位點(diǎn)，從而影響FOXO的磷酸化，影響FOXO的活性。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)能夠作用于胰島素受體，使其去磷酸化和失活。PTP在其活性位點(diǎn)上有一個(gè)氧化敏感型半胱氨酸，能夠被活性氧氧化，從而失活[8]。磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)通過(guò)催化磷酸肌醇的3′-去磷酸化來(lái)減弱PI3K信號(hào)傳導(dǎo)，和PTP類似，PTEN也能夠被活性氧滅活，PTEN暴露在H2O2中時(shí)，在其活性部位形成二硫鍵，從而失去活性[9]。Akt也能夠被活性氧氧化，從而抑制其活性。AKt暴露在活性氧中能形成亞磺酰化Akt，與親電子試劑反應(yīng)，如與脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯醛(HNE)邁克爾加成為敏感的半胱氨酸殘基，導(dǎo)致Akt抑制[10]。通常來(lái)說(shuō)FOXO磷酸化后都會(huì)出核，并失活，但FOXO6通過(guò)PI3K-AKt通路磷酸化后，雖然失活，但卻仍在核內(nèi)[11]。

1.2 ROS影響FOXO蛋白的乙酰化修飾 FOXO賴氨酸的乙?；揎椖軌蛴绊慒OXO的活性和穩(wěn)定性，減弱FOXO的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，還會(huì)使FOXO易受磷酸化和出核的影響，同時(shí)賴氨酸的乙?；材軌蚍€(wěn)定FOXO，使其免于相同位點(diǎn)的泛素化[12]。氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，特別是H2O2，是FOXO乙?；头核鼗年P(guān)鍵介質(zhì)。CREB結(jié)合蛋白CBP和P300是組蛋白乙酰化酶的兩個(gè)亞型，ROS介導(dǎo)FOXO乙酰化的分子機(jī)制已經(jīng)被初步闡明，外源性加入的低濃度的(25 μmol·L-1)H2O2能夠促進(jìn)p300/CBP乙酰轉(zhuǎn)移酶和FOXO4之間通過(guò)二硫鍵形成二聚體[13]，它們之間的連接通過(guò)FOXO4上的半胱氨酸殘基C477介導(dǎo)。這種FOXO的半胱氨酸殘基在人類和哺乳動(dòng)物中都是高度保守的，因此氧化還原敏感的異二聚體，可能為H2O2誘導(dǎo)的FOXO乙?；臋C(jī)制。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，在FOXO3a上的半胱氨酸殘基，并不和乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合[14]。

2 ROS在FOXO基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用

2.1 ROS影響miRNA對(duì)FOXO蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) 目前，在一些病理生理過(guò)程中許多miRNA已經(jīng)被作為FOXO表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，包括在抗原激活的TH淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增，老化期間造血干細(xì)胞(HSC)的維持，心臟肥大，和某些神經(jīng)退行性疾病中，都有此調(diào)節(jié)過(guò)程。許多直接作用于FOXO mRNA的miRNA也與腫瘤促進(jìn)，生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移有關(guān)：例如，在肺癌和黑色素瘤中miR-182靶向直接作用于FOXO3 mRNA[15];相同的FOXO3 mRNA也被miR-155靶向調(diào)控，促進(jìn)胰腺癌中的氧化應(yīng)激[16]。

經(jīng)過(guò)初步研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激能夠抑制Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號(hào)通路被細(xì)胞因子的激活[17]，隨后又發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，STAT5↑/miR-182↑/FOXO1↓信號(hào)通路，可以被快速轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)FOXO的表達(dá)(STAT5↓/miR-182↓/FOXO1↑)。將SK-N-MC人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞暴露于300 μmol·L-1的H2O2中，會(huì)使STAT滅活，10倍下調(diào)miR-182，最終使FOXO1蛋白水平增加4倍[18]。

2.2 ROS影響RNA結(jié)合蛋白對(duì)FOXO蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) HuR是一種AU富含元件(ARE)結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，可特異性的結(jié)合靶RNA的ARE，參與細(xì)胞存活，細(xì)胞分裂，免疫應(yīng)答，能夠促進(jìn)mRNA穩(wěn)定，并作為翻譯促進(jìn)因子[19]。通常在細(xì)胞核內(nèi)，感受應(yīng)激刺激后(包括氧化應(yīng)激)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境中后，會(huì)使p38-MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)激活，之后直接或間接刺激HuR磷酸化，導(dǎo)致其與靶mRNA的結(jié)合和在細(xì)胞質(zhì)中的積聚。HuR本身也是氧化還原的感受器，HuR為同源二聚體時(shí)得到全部活性。三個(gè)HuR RNA識(shí)別位點(diǎn)中的第一個(gè)半胱氨酸殘基通過(guò)形成分子間二硫鍵促進(jìn)同源二聚化[20]。因此氧化還原敏感的半胱氨酸，通過(guò)使HuR形成同源二聚體，應(yīng)答氧化應(yīng)激刺激。目前已在FOXO1 RNA的3′-UTR和內(nèi)含子區(qū)域鑒定出HuR結(jié)合位點(diǎn)[21]，而在FOXO3 mRNA中僅發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子中的HuR結(jié)合位點(diǎn)。HuR在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠穩(wěn)定FOXO1mRNA，提高FOXO1的蛋白水平。在5-氟尿嘧啶(5-FU)的應(yīng)激刺激下，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性HuR上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞FOXO1水平增加。5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡幾乎完全被同源siRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性HuR敲除所抑制，并在HuR-siRNA存在下通過(guò)異位FOXO1的過(guò)表達(dá)而重新發(fā)揮作用。 總之，這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)暴露于應(yīng)激刺激時(shí)，HuR介導(dǎo)FOXO1上調(diào)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

第二個(gè)參與FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的RNA結(jié)合蛋白是Quaking(QKI)[22]。是mRNA剪切、轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，協(xié)助調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和細(xì)胞周期，還起到腫瘤抑制的作用[23]。Galarneau和Richard[24]定義了QKI反應(yīng)元件(QRE)的共有序列(NACUAAY-N1-20-UAAY)，并使用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了小鼠中1 400個(gè)以上QKI mRNA靶標(biāo)。

在MCF- 7乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1 mRNA的3′-UTR結(jié)合了miR-27a，miR-96、miR-182和QKI蛋白、HuR蛋白[25]。用反義抑制劑靶向抑制這些miRNA和敲除QKI，它們對(duì)內(nèi)源性FOXO1表達(dá)影響相同，都導(dǎo)致FOXO1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)。對(duì)比HuR在FOXO1的mRNA 3′-UTR內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)ARE和QKI的結(jié)合位點(diǎn)QRE，發(fā)現(xiàn)在3′-UTR區(qū)域內(nèi)，第二個(gè)ARE與第三個(gè)QRE重疊。這種結(jié)合位點(diǎn)的排列提示了兩種調(diào)節(jié)蛋白對(duì)FOXO1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相互排斥的可能性。對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的5-FU處理導(dǎo)致FOXO1上調(diào)，同時(shí)上調(diào)HuR和下調(diào)QKI。 由此我們可以推測(cè)FOXO1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)涉及特定miRNA，HuR和QKI之間的功能性相互作用，以這種方式，F(xiàn)OXO1蛋白可以通過(guò)這些相互作用在轉(zhuǎn)錄后上調(diào)，以應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激刺激，包括氧化應(yīng)激。

未來(lái)的實(shí)驗(yàn)需要確定這兩種影響是否是獨(dú)立的，即在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)miRNA抑制和QKI敲除是否具有加性效應(yīng)并導(dǎo)致FOXO1上調(diào)增多。 另外，miRNA和QKI的作用可以相互關(guān)聯(lián)，然后預(yù)期僅針對(duì)一種因子(例如靶向miRNA)的治療也會(huì)阻止另一種因子(例如QKI)與3′-UTR的結(jié)合。

2.3 ROS影響p53對(duì)FOXO蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) 腫瘤抑制蛋白p53能夠維持基因組完整性。為了調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生的DNA損傷，野生型p53協(xié)調(diào)了許多基因的轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)靶基因的差異激活將細(xì)胞導(dǎo)向細(xì)胞周期停滯、衰老或凋亡，防止DNA繼續(xù)受損。最近有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子p53是FOXO3a的上游調(diào)節(jié)因子。順鉑和銀杏葉的藥理學(xué)研究表明，化療藥物誘導(dǎo)的ROS增加了癌基因C-myc[26],升高的C-myc水平抑制p21Cip1的p53-反式激活，抑制細(xì)胞周期停滯，但不影響促凋亡基因PUMA的p53-反式激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡激活。

除了ROS和p53通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用，ROS的直接作用也可能影響p53的激活。p53的穩(wěn)定性和活性受到多種共價(jià)翻譯后修飾的影響，如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等。p53的磷酸化，甲基化和乙?；ǔ?dǎo)致其穩(wěn)定，積累和活化。在這些翻譯后修飾中，ROS與p53介導(dǎo)的磷酸化有關(guān)，通過(guò)蛋白激酶，包括p38α-MAPK，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白(ATM)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)。然而，這些蛋白激酶的激活不一定是ROS特異性的，這些蛋白激酶是響應(yīng)DNA損傷的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的常見(jiàn)下游效應(yīng)物。由于存在含有氧化還原敏感型的半胱氨酸(Cys)，p53本身具有氧化還原活性。在p53 DNA結(jié)合域中存在兩個(gè)半胱氨酸簇，其對(duì)于p53與其共有序列的特異性結(jié)合是必需的。Cys 124、135、141、182和277位于p53的DNA結(jié)合域，構(gòu)成了氧化還原調(diào)制的結(jié)構(gòu)平臺(tái)。

從理論上講，蛋白質(zhì)中有多種可能的氧化巰基結(jié)構(gòu)，包括磺酸(-SOH)，二硫化物(-S-S-)，次磺酰胺(-SNR1R2)，亞磺酸(-SO2H)和磺酸(-SO3H)。已經(jīng)觀察到用氧化劑處理p53能夠取消它的DNA結(jié)合活性。最近的研究確定了p53氧化的作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在氧化劑處理后GSH會(huì)與Cys124、Cys124結(jié)合，連接通過(guò)二硫鍵與p53連接，降低p53的DNA結(jié)合活性，該過(guò)程可被抗氧化劑逆轉(zhuǎn)[27]。

3 ROS對(duì)FOXO的調(diào)節(jié)與FOXO轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子

轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC-1α是碳水化合物和脂質(zhì)代謝以及線粒體生物合成和功能的上游調(diào)節(jié)因子，并且能夠在不同的系統(tǒng)里調(diào)節(jié)FOXO的活性[28]。PGC-1α通過(guò)與FOXO1a共同作用，正向調(diào)節(jié)空腹誘導(dǎo)的肝臟糖異生。相似的，F(xiàn)OXO1a誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中硒蛋白P(SelP)的表達(dá)也能夠通過(guò)與PGC-1α共同作用而加強(qiáng)[29]。在內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中，PGC-1α也可以與FOXO3a共同作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)[30]。

在腎臟中，高脂飲食引起的腎臟脂毒性與胰島素抵抗和血脂異常有關(guān)，可能是由于FOXO3a和PGC-1α的下調(diào)和氧化應(yīng)激增加。給藥自由基清除劑TEMPOL,通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt-FOXO信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)預(yù)防腎損傷[30]，改善了高脂飲食誘導(dǎo)的腎損傷，這可能是由于FOXO3a和PGC-1α的上調(diào)導(dǎo)致了對(duì)氧化應(yīng)激和脂肪細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[31]。轉(zhuǎn)錄輔因子和賴氨酸脫甲基酶(KDM)通過(guò)與FOXO共同作用能夠誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)基因的表達(dá)，這表明該復(fù)合物的主要作用是維持氧化應(yīng)激抗性基因的基礎(chǔ)表達(dá)，而不是它們對(duì)外源氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[32]。該結(jié)果進(jìn)一步表明，F(xiàn)OXO進(jìn)入不同的染色質(zhì)環(huán)境和核微環(huán)境可能依賴于不同的輔助因子。

4 總結(jié)與展望

雖然氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，但低生理濃度的ROS，特別是過(guò)氧化氫，已成為激素和生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞代謝控制中不可缺少的信號(hào)分子。FOXO的活性和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)本質(zhì)上是相互聯(lián)系的，F(xiàn)OXO充當(dāng)細(xì)胞氧化還原傳感器，通過(guò)磷酸化，乙?；头核鼗诜g后進(jìn)行修飾，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響FOXO細(xì)胞質(zhì)核穿梭、FOXO穩(wěn)定，最終影響FOXO靶基因的轉(zhuǎn)錄。ROS也能夠在轉(zhuǎn)錄水平影響FOXO的表達(dá)，miRNA和p53是FOXO的上游信號(hào)分子，ROS能夠間接通過(guò)控制他們的活性來(lái)調(diào)節(jié)FOXO的表達(dá)。HuR和QKI是RNA結(jié)合蛋白，能夠與FOXO的RNA結(jié)合控制FOXO的轉(zhuǎn)錄，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HuR和QKI相互作用，使FOXO蛋白在轉(zhuǎn)錄后上調(diào)，以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激刺激。

此外，F(xiàn)OXO還能以氧化還原敏感的方式與其他蛋白(包括共調(diào)節(jié)因子和抗氧化酶)相互作用，并且有一些證據(jù)表明FOXO基因表達(dá)本身具有氧化還原敏感性調(diào)節(jié)作用。另一方面，一些FOXO靶基因是抗氧化酶，它們通過(guò)催化歧化和減少超氧化物和過(guò)氧化氫來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氧化還原狀態(tài)。 FOXO介導(dǎo)的基因表達(dá)的最終結(jié)果影響氧化損傷后的細(xì)胞命運(yùn)，誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡或細(xì)胞周期停滯和隨后的修復(fù)過(guò)程。在生理?xiàng)l件下，F(xiàn)OXOs參與細(xì)胞分化，能量代謝，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài),在與氧化應(yīng)激相關(guān)的一些病理?xiàng)l件下FOXO過(guò)度活化可能增加2型糖尿病的代謝紊亂或癌癥。所以需要繼續(xù)深入研究ROS對(duì)FOXO活性和表達(dá)的影響，從而能夠進(jìn)一步明確疾病的發(fā)病機(jī)制，為研發(fā)新的藥物提供思路。