楊龍旺，陳珺，林菁，潘文鋒，黃澤波

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

中醫(yī)將黃芪(Astragalusradix)、何首烏(Polygonimultifloriradix)和熟地黃(Rehmanniaeradixpraeparata)歸為補(bǔ)虛藥，認(rèn)為它們具有平衡人體陰陽(yáng)虛衰的功效[1]。黃芪最初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)之功效，現(xiàn)代用單味藥治療心臟疾?。缓问诪跏纵d于《何首烏傳》，藥用部位為干燥塊根，主要用于血虛諸證，現(xiàn)代通過(guò)配伍治療神經(jīng)衰弱和高血壓等；熟地黃首載于《本草拾遺》，用于血虛和肝腎陰虛諸證。模式動(dòng)物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，以下簡(jiǎn)稱秀麗線蟲)不僅具有生命周期短、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2]，而且其關(guān)鍵信號(hào)通路與人類同源性高，因而是研究天然產(chǎn)物和中藥活性的理想動(dòng)物模型[3]。我們?cè)孕沱惥€蟲為模型發(fā)現(xiàn)黃芪多糖不僅具有延緩衰老的作用，而且還能緩解多聚谷氨酰胺和6-羥多巴胺引起的神經(jīng)毒性因而具有抗神經(jīng)退行性疾病的潛在活性[4-5]。

衰老是人體各項(xiàng)機(jī)能衰退的綜合表現(xiàn)[6]，補(bǔ)虛藥具有調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能[7]，因而具有改善人體機(jī)能的潛在功效。據(jù)此，本文選用以黃芪、何首烏和熟地黃等補(bǔ)虛藥為主的復(fù)方湯劑，使用不同極性的化學(xué)試劑對(duì)復(fù)方湯劑進(jìn)行萃取得到相應(yīng)的萃取部位，并以對(duì)秀麗線蟲模型壽命的影響來(lái)探討各個(gè)部位的抗衰老作用。

1 材料

1.1 試劑 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氨水、三氯甲烷、二氯甲烷(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；2,2-二苯基-1-苦肼基(上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鋁、濃硫酸、香草醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；瓊脂(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(英國(guó)Oxoid公司)；氨芐青霉素、5-氟尿嘧啶(美國(guó)Sigma公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：二苯乙烯苷、蘆丁、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷(河南省商城縣標(biāo)物商貿(mào)有限公司伏山分公司)；D-(+)葡萄糖(阿拉丁)；旱蓮苷A、毛蕊花糖苷(廣東省藥品檢驗(yàn)所)；所有標(biāo)準(zhǔn)品含量均大于或等于98%。

秀麗線蟲和菌種：秀麗線蟲N2和大腸桿菌(OP50和NA22)購(gòu)買于美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗線蟲遺傳學(xué)中心(CaenorhabditisGenetics Center)。作為秀麗線蟲的食物，大腸桿菌OP50用于固體培養(yǎng)、NA22用于液體培養(yǎng)。

1.2 儀器 冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；純水儀(上海和泰儀器有限公司)；紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；薄層板(青島基億達(dá)硅膠試劑有限公司)；紫外-可見光分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

2 方法

2.1 復(fù)方湯劑的制備 本文復(fù)方湯劑以黃芪、何首烏和熟地黃等藥材為主，加水熬煮而成。

2.2 提取部位分離 復(fù)方湯劑的分離按如圖1所示的分離流程進(jìn)行。首先將200 mL原始湯劑和4倍體積的95%乙醇混合均勻，在4 ℃放置過(guò)夜后離心(6 620 rpm，10 min)。沉淀物用乙醇洗滌3次，于50 ℃水浴揮干殘留乙醇，再加適量水溶解，采用Sevag法除去蛋白，得到多糖部位；上清液依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇層另外再用等體積氨水洗滌，依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗滌部位和剩余水部位。所有部位在40 ℃水浴減壓濃縮至干，再繼續(xù)濃縮30 min以保證除去殘留的化學(xué)試劑，再各加適量水溶解，冷凍干燥，得到最終的分離部位備用。

圖1 復(fù)方湯劑的分離流程

2.3 秀麗線蟲壽命試驗(yàn) 秀麗線蟲壽命試驗(yàn)參考Zhang等[4]的方法進(jìn)行。將產(chǎn)卵期的秀麗線蟲裂解，將蟲卵轉(zhuǎn)移至S Medium液體培養(yǎng)基，在20 ℃、120 rpm和無(wú)食物條件下孵育23 h，然后加入食物細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)至即年輕成蟲期，轉(zhuǎn)移至96孔板進(jìn)行壽命試驗(yàn)。每孔總液體體積100 μL、蟲數(shù)20條左右，添加5-氟尿嘧啶(終濃度75 μg·mL-1)、氨芐青霉素(終濃度100 μg·mL-1)和食物(NA22細(xì)菌)。藥物濃度梯度設(shè)置為0.25、0.5、1、2、4、8 mg·mL-1，另外設(shè)置不加任何藥物空白組。在20 ℃、120 rpm條件下培養(yǎng)，10 d后每隔2 d統(tǒng)計(jì)1次秀麗線蟲的存活狀況，直至全部死亡。

2.4 薄層色譜分析 薄層色譜鑒定方法參照《中國(guó)藥典》2015年版進(jìn)行[8]。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：稱取標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加1 mL甲醇溶解；供試品溶液制備：稱取樣品5 mg，加1.5 mL甲醇溶解；點(diǎn)樣、展開和顯色：用玻璃毛細(xì)管分別蘸取約10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，點(diǎn)樣于硅膠薄層板上，使用現(xiàn)配的展開劑展開。

毛蕊花糖苷鑒定：使用乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=32∶1∶4溶劑展開，板面涂抹0.1%的2,2-二苯基-1-苦肼基乙醇試液；二苯乙烯苷鑒定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=20∶10∶1溶劑展開，在波長(zhǎng)365 nm的紫外光下檢視；蘆丁鑒定：使用乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶1∶1溶劑展開，板面噴涂5%的氯化鋁乙醇試液，熱風(fēng)加熱后，在365 nm紫外光下檢視；黃芪甲苷鑒定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=13∶7∶2溶劑展開，涂抹10%硫酸乙醇試液，熱風(fēng)吹至顯示清晰的斑點(diǎn)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷鑒定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=75∶25∶2溶劑展開，晾干后在254 nm紫外光下檢視；旱蓮苷A鑒：使用二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=30∶40∶15∶6溶劑展開，板面涂抹5%的香草醛硫酸試液，熱風(fēng)吹至板面出現(xiàn)清晰的斑點(diǎn)。

2.5 總糖含量測(cè)定 多糖部位總糖含量測(cè)定方法參照《中國(guó)藥典》2015年版進(jìn)行[8]。精密稱取多糖樣品20 mg加水溶解，置50 mL容量瓶中并稀釋至刻度，取5 mL定容至50 mL，搖勻。取供試品溶液2 mL，加4%苯酚溶液1 mL混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻。于40 ℃水浴中保溫30 min后取出，置冰水浴中5 min，以相應(yīng)試劑為空白在490 nm處測(cè)定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命的影響 原始湯劑以黃芪、何首烏和熟地黃為主組成，由于這些補(bǔ)虛藥具有生津養(yǎng)血、烏須發(fā)的作用[1]，所以本文首先檢測(cè)了原始湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命的影響。如圖2所示，原始湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命有一定的延長(zhǎng)作用，但與湯劑濃度有關(guān)。當(dāng)原始湯劑濃度為2 mg·mL-1時(shí)，秀麗線蟲的平均壽命有較明顯的提高(見圖2和表1)，說(shuō)明原始湯劑具有抗衰老的潛在作用。

圖2 復(fù)方湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命的影響

湯劑濃度/mg·mL-1平均值±SE/d中位值/d最大值/d動(dòng)物數(shù)(條)P值017.07±0.461733165-0.2516.95±0.3915331580.506 40.517.23±0.4715351310.995 4117.58±0.4815391550.442 6219.85±0.5619391510.000 2416.22±0.5715391480.550 9816.25±0.7211391470.641 9

3.2 復(fù)方湯劑萃取部位的質(zhì)量和提取率 由于原始湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命有一定的延長(zhǎng)作用，但與其濃度有關(guān)，因此本文接著對(duì)原始湯劑進(jìn)行了萃取分離，得到多糖部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗滌部位和剩余水部位等6個(gè)部位，其質(zhì)量和提取率見表2。其中，多糖部位提取率最高，達(dá)8.6%，但石油醚部位和經(jīng)氨水洗滌后的正丁醇部位的提取率不到1%。

表2 復(fù)方湯劑分離部位的質(zhì)量和提取率

3.3 復(fù)方湯劑萃取部位對(duì)秀麗線蟲壽命的影響 根據(jù)上述結(jié)果，本文利用秀麗線蟲壽命實(shí)驗(yàn)對(duì)所得萃取部位進(jìn)行了檢測(cè)。其中，石油醚部位含量過(guò)低，沒(méi)有開展壽命實(shí)驗(yàn)。正丁醇部位在給藥第13天、氨洗滌部位在給藥第10天時(shí)，秀麗線蟲基本死亡，實(shí)驗(yàn)終止。乙酸乙酯部位和剩余水部位對(duì)秀麗線蟲的壽命沒(méi)有延長(zhǎng)作用，但多糖部位表現(xiàn)出一定的壽命延長(zhǎng)作用。如圖3和表3所示，當(dāng)濃度為8 mg·mL-1時(shí)，多糖部位對(duì)秀麗線蟲的平均壽命提高了約10%。由于多糖部位具有潛在的抗衰老活性，本文采用苯酚濃硫酸法對(duì)其總糖含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示其糖含量為50%。

圖3 復(fù)方湯劑多糖萃取部位對(duì)秀麗線蟲壽命的影響

樣品濃度/mg·mL-1平均值±SE/d中位值/d最大值/d總蟲數(shù)(條)P值016.69±0.391725115-0.2518.12±0.4717401280.098 10.517.94±0.4417401290.061 9117.64±0.4117401270.193 9217.83±0.3817401440.127 6417.87±0.4517371380.170 4818.58±0.721737860.001 3

3.4 復(fù)方湯劑主要代表成分的鑒定 本文原始湯劑以黃芪、何首烏、熟地黃等為主組成，據(jù)此本文對(duì)原始樣品和分離所得部位的代表性成分用薄層色譜進(jìn)行了鑒定。如圖4所示，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，存在5種化合物:蘆丁(乙酸乙酯部位)、旱蓮苷A(乙酸乙酯部位)、二苯乙烯苷(石油醚部位)、黃芪甲苷(正丁醇部位)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(正丁醇部位)。

A.旱蓮苷A的鑒定；B.毛蕊花糖苷的鑒定；C.二苯乙烯苷的鑒定；D.蘆丁的鑒定；E.黃芪甲苷的鑒定；F.毛蕊異黃酮葡萄糖苷的鑒定。色譜板中樣品a～g分別為原始湯劑、多糖部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗滌部位和剩余水部位；樣品h～m分別為旱蓮苷A、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、蘆丁、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品圖4 復(fù)方湯劑中代表性成分的薄層板色譜鑒定

4 結(jié)論

本文首先檢測(cè)了原始復(fù)方湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命的影響，發(fā)現(xiàn)原始湯劑對(duì)秀麗線蟲壽命有一定的延長(zhǎng)作用，但與湯劑濃度有關(guān)。接著通過(guò)對(duì)復(fù)方湯劑進(jìn)行萃取分離，得到不同提取部位，活性結(jié)果顯示多糖部位能夠延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命。針對(duì)復(fù)方湯劑及其萃取部位開展的鑒定和分析發(fā)現(xiàn)，石油醚部位含有二苯乙烯苷、乙酸乙酯部位含有旱蓮苷A和蘆丁、正丁醇部位含有黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，多糖部位的總糖含量在50%以上。

許多研究表明，中藥多糖對(duì)衰老及相關(guān)疾病具有重要作用。例如，我們?cè)?jīng)報(bào)道黃芪多糖能夠抑制亨廷頓舞蹈病秀麗線蟲模型體內(nèi)多聚谷氨酰胺(PolyQ)的聚集并能有效緩解PolyQ聚集產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，同時(shí)還能延長(zhǎng)秀麗線蟲的壽命[4]。在6-羥多巴胺引起的神經(jīng)毒性秀麗線蟲模型中，黃芪多糖也能夠緩解毒性并提高抗氧化酶活性[5]。此外，有報(bào)道顯示，何首烏多糖和熟地黃多糖都有一定的抗氧化作用[9-10]。因此，在本文工作基礎(chǔ)上，可以針對(duì)復(fù)方湯劑的多糖組分及其組合開展進(jìn)一步的研究。