鮮義坤1,李 果,李裕冬1,王承東,熊鐵一1,張貴權

(1.四川省自然資源科學研究院,四川 成都610041;2.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業(yè)和草業(yè)局重點實驗室，四川 臥龍 623006；3.中國大熊貓保護研究中心,四川 臥龍623006)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)母乳不但具有營養(yǎng)價值和免疫功效,而且通過氣味方式傳遞某些信息,如引誘幼仔吸食等。目前，對圈養(yǎng)大熊貓乳汁的營養(yǎng)成分[1-9]和活性物質(zhì)[10-12]已有部分研究,但揮發(fā)性有機成分和香氣成分國內(nèi)外尚未見報道。

頂空(HS)—固相微萃取(SPME)技術始創(chuàng)于20世紀90年代,是一種分析揮發(fā)性化合物的前處理技術;氣相色譜(GC)—質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術可對樣品中的揮發(fā)性組分進行分離和鑒定。隨著這兩項技術的日臻完善,HS-SPME結(jié)合GC-MS開辟了國內(nèi)外分析未知混合型揮發(fā)性成分的嶄新局面。由于具有操作簡便、不加溶劑、用樣量少、靈敏度高、檢測高效、結(jié)果準確等特點,HS-SPME-GC-MS分析法現(xiàn)已廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、探索生物奧秘、偵查案件等領域分析測定微量甚至痕量的揮發(fā)性有機物質(zhì)(VOCs)。鑒于大熊貓乳汁極為珍貴,樣品難以采集,本文在比較了多種分析測定方法的優(yōu)缺點之后,結(jié)合具體實際情況,優(yōu)選了當今主流的HS-SPME-GC-MS方法用于測試圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs和香氣成分。

部分學者曾用HS-SPME-GC-MS方法分析過羊乳和牛乳中的揮發(fā)性化合物[13-15]、豬乳中的風味物質(zhì)[16,17],為本項研究提供了可參考的方法。測試大熊貓乳汁中的VOCs,再細究VOCs中的香氣成分是在理論上探索大熊貓乳汁香氣成因和乳源性化學信息素的簡捷路徑。本文旨在填補大熊貓乳汁香氣成分方面的資料空白,為研制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專用誘食劑提供原料選擇的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動物

本文選擇4只健康狀況良好、泌乳機能正常的圈養(yǎng)大熊貓母獸(表1)作為研究對象。供試母獸飼養(yǎng)在中國大熊貓保護研究中心臥龍神樹坪基地(簡稱“大熊貓中心”),日糧以竹稈為主,以竹葉、窩窩頭、胡蘿卜、蘋果等為輔,自由采食和飲水,圈內(nèi)隨意活動,按照大熊貓中心既定的哺乳期飼養(yǎng)規(guī)程進行日常飼喂和管理。

表1 供試大熊貓母獸基本信息與乳汁樣品采集日期

1.2 乳汁樣品采集、運輸與保存

由大熊貓中心富有經(jīng)驗的飼養(yǎng)員在大熊貓母獸非物理和非化學保定的狀態(tài)下采用人工擠乳法采集乳汁樣品。母獸產(chǎn)仔日期、人工采乳日期、采乳時母獸年齡與幼仔日齡、母獸呼名等基本信息見表1。乳樣直接擠入已清洗干凈并經(jīng)濕熱高溫(≥121℃,20min)滅菌除味的離心管(≥10mL)中,旋緊管帽,再用無味的封口膜纏繞帽口與管頸結(jié)合處數(shù)圈確保密封,以防止乳樣氣味散失和串入其他氣味;對乳樣管進行標注、登記、裝袋后盡快置于裝有20kg干冰的紙箱中,密封,采用汽車運輸。上述樣品保存于四川省自然資源科學研究院種質(zhì)室-80℃冰箱中備用。根據(jù)免疫球蛋白含量的測定結(jié)果,有關文獻[11]認為圈養(yǎng)大熊貓產(chǎn)后5天內(nèi)的乳汁才是真正意義上的初乳,5天后的乳汁應為常乳。由表1可知,本文所用乳樣為產(chǎn)后10—56天的乳汁,屬常乳。

1.3 HS-SPME方法

取10mL乳樣置入20mL的頂空瓶中,加入3g NaCl(國產(chǎn)分析純,成都市科龍化工試劑廠),用密封墊和鋁蓋迅速密封頂空瓶,震蕩,以促進NaCl溶解;將已老化的萃取頭(250℃下老化,SPME頭和手動進樣手柄均為美國Supelco公司出品)插入頂空瓶,推出萃取纖維頭至離液面約1cm處;將頂空瓶和萃取頭置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi),固定,60℃或70℃分別頂空萃取1—4h(表2),其間每隔0.5h晃動1次;縮回萃取纖維頭,拔出后快速插入GC進樣口,推出萃取頭解吸。

表2 乳汁樣品與香氣成分的探尋方法

1.4 GC-MS聯(lián)用分析

測試方法一:GC-MS聯(lián)用儀為QP 2010Plus(日本島津公司)。方法為:①GC條件。色譜柱為非極性石英毛細管柱(美國Agilent公司),型號為DB-5MS,規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm,柱箱溫度40℃,進樣溫度270℃,進樣模式不分流,進樣時間1min,載氣為高純氦氣,流量控制模式壓力49.5kPa,總流量16.0mL/min、柱流量1.0mL/min、線流量36.1cm/s,吹掃流量進樣模式5.0mL/min,分流比10.0;程序升溫模式的起始溫度40℃,保持5min,以5℃/min速率升溫至80℃,保持5min,再以10℃/min速率升溫至280℃,保持15min。②MS條件。接口溫度220℃,離子源溫度200℃,電離方式為EI,電子能量70eV,質(zhì)量掃描范圍(m/z)23—500。③數(shù)據(jù)處理。主要利用GC-MS工作站軟件和自帶NIST標準譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)。定性檢測需組分質(zhì)譜圖與標準譜圖的匹配度≥80%,結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律,同時參照保留時間推定乳汁中的VOCs。定量檢測按峰面積歸一化法儀器自動計算各組分的相對百分含量。

測試方法二:GC-MS聯(lián)用儀為Agilent 7890B-5977B(美國Agilent公司)。方法為:①GC條件。色譜柱為強極性石英毛細管柱(美國Agilent公司),型號為HP-INNOWax,規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm,進樣口溫度為250℃,載氣為高純氦氣,柱流量0.80mL/min,進樣模式為分流,分流比為5∶1;程序升溫模式的起始溫度45℃,保持2min,以5℃/min速率升溫至120℃,再以10℃/min速率升溫至200℃,最后以15℃/min速率升溫至280℃,保持10min,解吸3min。②MS條件。傳輸線接口溫度250℃,離子源溫度230℃,離子源為EI,電子能量70eV,四極桿溫度150℃,質(zhì)量掃描范圍20—450amu。③數(shù)據(jù)處理。將采集到的質(zhì)譜圖經(jīng)GC-MS配套的計算機自動檢索,初步鑒定成分物質(zhì),再與Wiley第11版譜庫和NIST2014版+2017版Library中的標準譜圖進行人工檢索匹配,結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律人工解譜,匹配度≥80%同時參照保留時間推定乳汁中的VOCs,按峰面積歸一化法儀器自動計算各組分的相對百分含量?；蛟S因為圈養(yǎng)大熊貓乳汁的特殊化學性質(zhì),在檢出后剔除從色譜柱和SPME頭上掉下的硅氧烷等“外來”物質(zhì),不計入統(tǒng)計分析。

乳汁樣品與測試方法:為了探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中較多的香氣成分,在HS-SPME-GC-MS分析的總方法下,對不同的乳樣采用了不同的HP-SPME處理和GC-MS方法(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼仔10日齡時“娜娜”乳汁中的VOCs

按表2進行樣品前處理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法一測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔10日齡時乳汁中的VOCs組成見表3、圖1。

表3 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔10日齡時乳汁中的VOCs

圖1 “娜娜”在幼仔10日齡時乳汁中VOCs總離子流色譜圖

共測試出30種VOCs,其中可確定(匹配度≥80%,下同)的VOCs有24種,分別是環(huán)戊烷、3-甲基丁醛、1,4-二甲基苯、α-氰基芐醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、1,2,4-三甲基苯、1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、壬醛、1-甲基-2-異丙基苯、4-烯苯基甲苯、反式-1-丁烯基苯、叔丁基苯、甘菊環(huán)、1,3-二乙基-4-甲基苯、2,3-二氫-1,3-二甲基-1H-茚、1,2,3,4,5-五甲基苯、1-甲基萘、2-甲基萘、2,3-二甲基萘、2-乙基萘、1-乙基萘,歸類于醇1種、酚1種、醛3種、烷烴1種、烯烴2種、芳香烴15種、含氮化合物1種,有7種成分(匹配度<80%的成分未計入,下同)也存在于羊乳[14]或牛乳[14,15]或豬乳[16,17]中。由表3、圖1可知,在幼仔10日齡時“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相對含量合計達76.35%,由高到低依次是3-甲基丁醛(48.77%)、苯酚(14.72%)、1-甲基萘(4.79%)、3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮(有待進一步確定,4.20%)、甘菊環(huán)(3.87%)。對“娜娜”哺乳仔獸10日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是3-甲基丁醛和苯酚。3-甲基丁醛具有尖刺的、青香、巧克力樣香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有青香氣息[19]大致相符。

2.2 幼仔23日齡時“娜娜”乳汁1中的VOCs

按照表2進行樣品前處理(SPME60℃,2h)和GC-MS方法二測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時乳汁中的VOCs組成見表4、圖2。

表4 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時乳汁1中的VOCs

注:—表示儀器未自動算出，表5—8同。

共測試出36種VOCs,其中可確定的VOCs有22種,分別屬于醇5種、酚4種、醛4種、酮2種、羧酸4種、雜環(huán)化合物2種、烯烴1種,有12種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表4、圖2可知,在幼仔23日齡時“娜娜”乳汁中排前五位(含1個并列)的VOCs相對含量合計65.45%,由高到低依次是己醛(32.92%)、苯酚(9.92%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(7.58%)、1-戊烯-3-醇(5.73%)、己酸(4.65%)和戊醛(有待進一步確定,4.65%)。對“娜娜”哺乳仔獸23日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有強烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前一次VOCs測試分析的基礎上除3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、苯酚4種成分相同外,新發(fā)現(xiàn)了18種VOCs(匹配度<80%的成分未計入,下同),分別是:2-甲基-3-丁烯-2-醇、己醛、1-戊烯-3-醇、2-戊基呋喃、1-戊醇、1-辛烯-3-酮、2,3-辛二酮、順式-2-戊烯-1-醇、反式,反式-2,4-庚二烯醛、乙酸、苯甲醛、丁酸、己酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-(1-氧代丙基)苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、吲哚、苯甲酸。與上次測試相比,結(jié)果差異可能是因為采用了不同型號的SPME頭、不同極性的色譜柱、不同的泌乳時期以及不同廠家的GC-MS聯(lián)用儀所致。

圖2 “娜娜”在幼仔23日齡時乳汁1中VOCs總離子流色譜圖

2.3 幼仔23日齡時“娜娜”乳汁2中的VOCs

按表2進行樣品前處理(SPME70℃,1h)和GC-MS方法二測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時乳汁中的VOCs組成見表5、圖3。

表5 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時乳汁2中的VOCs

共測試出30種VOCs,其中可確定的VOCs有20種,分別屬于醇3種、酚2種、醛4種、酮3種、羧酸5種、雜環(huán)化合物2種、烯烴1種,有12種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表5、圖3可知,在幼仔23日齡時“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相對含量合計為50.65%,由高到低依次為己醛(14.29%)、苯酚(13.01%)、戊醛(有待進一步確定,10.27%)、己酸(6.58%)、1-辛烯-3-醇(6.50%)。對“娜娜”哺乳仔獸23日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有強烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前兩次VOCs測試分析的基礎上又新發(fā)現(xiàn)了反式-2-戊烯醛、2-庚酮、2,5-辛二酮、順式-2-庚烯醛、順式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、辛酸6種VOCs。與上次測試相比,結(jié)果差異可能是因為SPME溫度和時長的不同所致。

2.4 幼仔56日齡時“嘉嘉”乳汁中的VOCs

按表2進行樣品前處理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“嘉嘉”在幼仔56日齡時乳汁中的VOCs組成見表6、圖4。

圖3 “娜娜”在幼仔23日齡時乳汁2中VOCs總離子流色譜圖

表6 圈養(yǎng)大熊貓“嘉嘉”在幼仔56日齡時乳汁中的VOCs

共測試出20種VOCs,其中可確定的VOCs有10種,分別屬于酚1種、酮1種、羧酸4種、雜環(huán)化合物3種、芳香烴1種,有7種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表6、圖4可知,在幼仔56日齡時“嘉嘉”乳汁中排前五位的VOCs相對含量合計為99.18%,由高到低依次是2-丁酮(87.78%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(有待進一步確定,4.21%)、3-戊酮(有待進一步確定,3.54%)、己酸(2.81%)、苯酚(0.84%)。對“嘉嘉”哺乳仔獸56日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是2-丁酮。2-丁酮具有醚香、水果、樟腦、酮香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有青香氣息[19]大致相符。在前三次VOCs測試分析的基礎上又新發(fā)現(xiàn)了2-丁酮、吡咯和1-甲基-2-吡咯烷酮3種VOCs。與上次測試相比,結(jié)果差異可能是因為個體遺傳、母獸年齡、泌乳階段、SPME時長的不同所致。

圖4 “嘉嘉”在幼仔56日齡時乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.5 幼仔23日齡時“喜豆”乳汁中的VOCs

按表2進行樣品前處理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“喜豆”在幼仔23日齡時乳汁中的VOCs組成見表7、圖5。

表7 圈養(yǎng)大熊貓“喜豆”在幼仔23日齡時乳汁中的VOCs

共測試出25種VOCs,其中可確定的VOCs有15種,分別屬于醇4種、酚2種、醛3種、酮1種、羧酸3種、雜環(huán)化合物1種、芳香烴1種,有11種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表7、圖5可知,在幼仔23日齡時“喜豆”乳汁中排前五位的VOCs相對含量合計為91.95%,由高到低依次是苯酚(46.15%)、己醛(18.87%)、2-戊酮(16.09%)、3-己烯-1-醇(5.97%)、己酸(4.87%)。對“喜豆”哺乳仔獸23日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是苯酚和己醛。苯酚具有酚樣、藥香氣[18],己醛具有強烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前四次VOCs測試分析的基礎上又新發(fā)現(xiàn)了乙醇、2-戊酮、1,3-二甲基苯、3-己烯-1-醇、苯甲醇、4-甲基苯酚、2,3-二氫苯并呋喃7種VOCs。與上次測試相比,結(jié)果差異可能是因為個體遺傳、母獸年齡、泌乳階段的不同所致。

圖5 “喜豆”在幼仔23日齡時乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.6 幼仔56日齡時“紳賓”乳汁中的VOCs

按照表2進行樣品前處理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法二測試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”在幼仔56日齡時乳汁中的VOCs組成見表8、圖6。

表8 圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”在幼仔56日齡時乳汁中的VOCs

(續(xù)表8)

序號保留時間(min)VOCs名稱分子式分子量匹配度(%)相對含量(%)家畜乳汁中的檢出情況96.2583,7-二甲基癸烷C12H26170810.94106.521己醛C6H12O1009633.76牛乳[15]、豬乳[17]117.471十二酸甲酯C13H26O221481—127.735反式-2-戊烯醛C5H8O84870.72137.8651,4-二甲基苯C8H10106940.86羊乳和牛乳[14]、豬乳[17]148.6461-戊烯-3-醇C5H10O86721.91159.0882-庚酮C7H14O114890.92牛乳[15]169.163庚醛C7H14O114831.02179.243十二烷C12H26170911.56牛乳[14]189.5812-甲基十二烷C13H28184760.561910.1232-己烯醛C6H10O9883—2010.4172-戊基呋喃C9H14O138941.792110.5614,5-二甲基壬烷C11H24156741.642211.0541-戊醇C5H12O88904.03牛乳[15]2311.4771-甲基-2-異丙基苯C10H14134940.412411.9342-辛酮C8H16O12887—2512.079十五烷C15H32212491.04羊乳和牛乳[14]2612.4221-辛烯-3-酮C8H14O126781.102713.029反式-2-庚烯醛C7H12O112931.542813.1192,3-辛二酮C8H14O2142722.952914.900壬醛C9H18O142901.76羊乳[14]、牛乳[15]3015.2733-辛烯-2-酮C8H14O126870.343115.517順式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯C9H16124870.613215.8602-辛烯醛C8H14O126962.823316.4271-辛烯-3-醇C8H16O128904.423416.5171-庚醇C7H16O116720.703516.845反式,反式-2,4-庚二烯醛C7H10O110950.333617.303乙酸C2H4O260640.33羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]3717.5472,4-庚二烯醛C7H10O110900.233818.2033,5-辛二烯-2-酮C8H12O124720.283918.353苯甲醛C7H6O106952.38羊乳和牛乳[14]、牛乳[17]4019.0741-辛醇C8H18O130910.554119.432反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮C8H12O124300.454220.358苯甲腈C7H5N10383—牛乳[15]、豬乳[16]也檢出腈類化合物4320.492反式-2-辛烯-1-醇C8H16O128500.304421.2931-壬烯-4-醇C9H18O142500.254521.373丁酸C4H8O288810.34羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]4621.631己酸烯丙酯C9H16O2156722.454722.507反式,反式-2,4-壬二烯醛C9H14O13850—豬乳[16,17]4823.567N-乙烯基吡咯烷酮C6H9NO11156—4923.9452-庚基呋喃C11H18O166640.665024.860反式,反式-2,4-癸二烯醛C10H16O152450.88牛乳[15]、豬乳[17]5125.890己酸C6H12O2116803.12羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]5226.129苯甲醇C7H8O10897—5327.497庚酸C7H14O213064—羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]5428.084苯酚C6H6O94900.47羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5528.303γ-壬內(nèi)酯C9H16O2156870.56牛乳[15]5628.861辛酸C8H16O2144970.56羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]5730.045壬酸C9H18O2158830.18羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5830.249δ-壬內(nèi)酯C9H16O2156870.265931.129癸酸C10H20O2172940.19羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]6032.776吲哚C8H7N11790—羊乳[14]

共測試出60種VOCs,其中可確定的VOCs有39種,分別屬于醇4種、酚1種、醛11種、酮4種、羧酸5種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物3種、含氮化合物1種、烷烴4種、烯烴1種、芳香烴2種,有17種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。

由表8、圖6可知,在幼仔56日齡時“紳賓”乳汁中排前五位的VOCs含量合計為54.45%,由高到低依次是己醛(33.76%)、2-丁酮(8.69%)、1-辛烯-3-醇(4.42%)、1-戊醇(4.03%)、戊醛(3.55%)。對“紳賓”哺乳仔獸56日齡時乳汁香氣的形成可能起到主要或主導作用的成分是己醛和2-丁酮。己醛具有強烈的青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],2-丁酮具有醚香、水果、樟腦、酮香氣[18],與我們品評的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前五次VOCs測試分析的基礎上又新發(fā)現(xiàn)了20種VOCs,分別是2-乙基呋喃、戊醛、3,6-二甲基癸烷、5-甲基癸烷、3,7-二甲基癸烷、十二酸甲酯、庚醛、十二烷、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、3-辛烯-2-酮、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇、苯甲腈、γ-壬內(nèi)酯、壬酸、δ-壬內(nèi)酯、癸酸。與上次測試相比,結(jié)果差異可能是因為個體遺傳、母獸年齡、泌乳階段、SPME時長不同和嗅感香氣較強所致。

圖6 “紳賓”在幼仔56日齡時乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.7 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分

綜上所述,通過不同型號的SPME頭、不同的SPME溫度和時長、不同的GC-MS聯(lián)用儀、不同類型的毛細管柱、不同的程序升溫等乳樣前處理和儀器分析關鍵節(jié)點的變化對不同個體、不同年齡、不同泌乳階段、新鮮或不同凍藏天數(shù)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁進行了測試,旨在較多地探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs數(shù)量。上述6次測試結(jié)果共計測出112種VOCs(未計相互之間重復的成分),其中可確定的VOCs共有78種,分別屬于醇9種、酚5種、醛14種、酮8種、羧酸7種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物6種、含氮化合物2種、烷烴5種、烯烴3種、芳香烴16種,可見圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs以芳香烴類、醛類、醇類、酮類、羧酸類等為主;有28種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[16,17]中,分別屬于醇1種、酚4種、醛5種、酮3種、羧酸7種、內(nèi)酯1種、雜環(huán)化合物1種、烷烴1種、芳香烴5種,說明大熊貓乳汁與家畜乳汁(羊乳或牛乳或豬乳)既有相同的成分,又存在50種VOCs的較大差異,這可能是因為種間遺傳、食物結(jié)構(gòu)、代謝類型及分析方法等不同所致,也可能是大熊貓乳汁香氣與羊乳香氣、牛乳香氣、豬乳香氣有差異的直接原因。若將上述6次測試結(jié)果(表3—8、圖1—6)的VOCs相對含量排前五位的成分合并進行算術平均計算,表明在幼仔10—56日齡時6—14歲的圈養(yǎng)大熊貓乳汁中平均相對含量較高(前十位)的VOCs是:己醛(16.64%)、2-丁酮(16.08%)、苯酚(14.11%)、3-甲基丁醛(8.13%)、己酸(3.15%)、戊醛(3.08%)、2-戊酮(2.68%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(1.97%)、1-辛烯-3-醇(1.82%)、3-己烯-1-醇(1.00%),這些成分對圈養(yǎng)大熊貓乳汁主要香氣韻調(diào)的形成可能起到主要或主導作用,由此可知醛類(27.85%)和酮類(18.76%)是圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的重要貢獻物質(zhì)種類。

從圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測出的VOCs幾乎都有一定的氣味，或淡或濃，或香或臭，但有些氣味物質(zhì)沒有通過甚至沒有進行食品安全評估，不能用作食品級單體香原料。圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分是從上述測定的112種VOCs中篩選出國際國內(nèi)公認、法規(guī)允許在食品中添加并可購買的單體呈香物質(zhì)(即狹義上的香氣成分，下同)見表9。結(jié)果顯示:圈養(yǎng)大熊貓乳汁中可確定的香氣成分有46種,分別歸類于醇9種、酚3種、醛12種、酮7種、羧酸7種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物4種、芳香烴1種,可見圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分以醛類、醇類、酮類、羧酸類、雜環(huán)化合物等為主,醛類香氣成分對圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的形成可能起到重大作用。

表9 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測出的香氣成分、香氣特征及其國內(nèi)外食品應用的法規(guī)狀態(tài)

(續(xù)表9)

香氣成分測出的圈養(yǎng)大熊貓乳樣編號123456FEMA編號香氣特征[18,20-23]國內(nèi)外食品應用的法規(guī)狀態(tài)中國美國歐盟日本反式-2-辛烯醛※※?3215尖刺的、脂肪、肉香、青香氣√√√√壬醛※???※※2782脂肪、花香、蠟香、柑橘香氣√√√√1-甲基萘※3193類似萘、樟腦香氣√√××2-乙基呋喃?※3673豆香、面包、麥芽、溶劑樣、焦糊香氣√√×√2-甲基-3-丁烯-2-醇※※??無××√×己醛※※※※2557強烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣√√√√2-庚酮?※?※2544水果、青香、奶油、奶酪香氣√√√√1-戊烯-3-醇※???3584尖刺的、蔬菜、熱帶水果、芥末香氣√√√√2-戊基呋喃※※※3317果香、青香、壤香、骨粉香、根香香氣√√√√1-戊醇※※※※2056蘋果、香蕉、酵母、酒香香氣√√√√1-辛烯-3-酮※※??3515蘑菇、油膩的氣息√√√√2,3-辛二酮※??4060甜的、奶油香√√√√順式-2-戊烯-1-醇※4305香蕉、青香、橡膠氣息×√√×3-辛烯-2-酮??※3416壤香、蘑菇、肉、椰子香氣√√√√反式,反式-2,4-庚二烯醛※※3164青香、脂肪、水果、辛香香氣√√√√乙酸※※※??2006尖刺的、醋香氣√√√√苯甲醛※※?※※2127杏仁、果香、粉香、堅果香氣√√√√丁酸※※※※※2221牛奶、奶油、黃油、奶酪、果香香氣√√√√己酸※※※※※2559強烈的、腐臭奶酪香氣√√√√2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚※2184烘烤谷物香氣,抗氧化劑、防腐劑╳×√××辛酸?※※※※2799甜的、干酪、脂肪、青草、油脂香氣√√√√壬酸?※2784脂肪、蠟、奶酪、椰子香氣√√√√吲哚※※※※2593溫和的、動物糞便香氣√√√√苯甲酸※※2131極弱的膏香√√√×2-丁酮?※※2170醚香、水果、樟腦、酮香氣√√√√戊醛??※3098令人愉快的、面包、巧克力香氣√√√√吡咯※3386甜的、令人作嘔的香氣√√√√乙醇※2419有酒的氣息╳×√√×2-戊酮※2842甜的、醚香、香蕉、水果香氣√√√√3-己烯-1-醇※無藥草香氣××√√苯甲醇※※2137甜的、花香、果香香氣√√√√4-甲基苯酚※2337藥、酚樣香氣√√√√十二酸甲酯※2715蠟、油、奶油、椰子、蘑菇、葡萄酒、脂肪香氣√√√√2-己烯醛※2560青香、辛香、蘋果、脂肪、青草、醛香香氣√√√√2-辛酮※2802脂肪、花香、青香、牛奶、奶酪香氣√√√√反式-2-庚烯醛※3165青香、果香、脂肪、肉香、家禽香氣√√√√2-辛烯醛※3215尖刺的、脂肪、肉香、青香氣√√√√2,4-庚二烯醛※3164青香、脂肪、水果、辛香香氣√√√√1-辛醇※2800青香、柑橘、甜橙、醛香、甜花香、蠟香香氣√√√√γ-壬內(nèi)酯※2781脂肪、椰子、奶油香氣√√√√δ-壬內(nèi)酯※3356甜的、椰子、脂肪、牛奶、奶油、堅果香氣√√√√癸酸※2364脂肪、腐臭的香氣√√√√具※/有FEMA編號/√物質(zhì)總數(shù)61915813304441444340具?/無FEMA編號/╳物質(zhì)總數(shù)17646425236合計呈香物質(zhì)總數(shù)726211219344646464646

注:香氣成分僅限于可在食品中使用的、已商品化的單體呈香物質(zhì)即單體香原料,以本文表3—8出現(xiàn)的先后為序;FEMA為Flavor and Extract Manufactures Association of the United States的縮寫,FEMA編號在國際上普遍采用;國內(nèi)外食品應用的法規(guī)狀態(tài)匯總資料來源于我國臺灣香料協(xié)會,2017年12月22日網(wǎng)上發(fā)布;※表示匹配度≥80%;?表示匹配度<80%;√表示允許食品中使用;×表示禁止食品中使用。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成因

圈養(yǎng)大熊貓乳汁是有香氣的。我們曾對7只圈養(yǎng)大熊貓的乳汁進行過香氣品鑒,含有新鮮竹葉樣青香、新鮮竹稈樣青香、乳香氣、奶腥氣、乳脂香、奶甜氣、酸香氣等[19]。測試結(jié)果表明，圈養(yǎng)大熊貓乳汁的這些香氣均有物質(zhì)基礎,盡管呈香物質(zhì)的探尋還不徹底,某些香氣成分種類可能還不全面,但基本能說明圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣形成的直接物質(zhì)原因。從表9可知,具有青香氣息的物質(zhì)最多,達14種,分別是:3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、反式-2-辛烯醛、己醛、2-庚酮、2-戊基呋喃、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇,其中己醛為圈養(yǎng)大熊貓乳汁中平均相對含量(6次測試的算術平均值)最高的香氣成分,因其香氣閾值較低,對圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣有重大貢獻,這就不難解釋為什么圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有較強的新鮮竹葉樣青香氣和新鮮竹稈樣青香氣,這些成分可能共同構(gòu)成了圈養(yǎng)大熊貓乳汁的特征性香氣。乳香氣可能與丁酸、己酸、δ-壬內(nèi)酯、癸酸等有關,奶腥氣可能與己醛、2-己烯醛[24]、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇[25]等有關,乳脂香氣可能與庚醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、壬酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、γ-壬內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、癸酸等有關,奶甜氣可能與2,3-辛二酮、辛酸、吡咯、2-戊酮、苯甲醇、1-辛醇、δ-壬內(nèi)酯等有關,酸香氣主要與乙酸等揮發(fā)性羧酸有關?？梢娙︷B(yǎng)大熊貓乳汁中的某種香氣并非單獨由1種香氣成分引起,而是多種呈香物質(zhì)相互作用(協(xié)同增效或抵消減弱)結(jié)果的綜合表象。圈養(yǎng)大熊貓個體間乳汁香氣可能因為遺傳、年齡、泌乳階段、食物結(jié)構(gòu)等因素的不同而存在一定差異[19],是因為不同泌乳階段、不同年齡、不同個體的VOCs種類數(shù)量及其相對含量不盡相同所致(表3—8),這在圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成分的探尋結(jié)果得到驗證(表9)。這些香氣成分可能來源于圈養(yǎng)大熊貓機體尤其是母獸乳腺物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物,也可能從食物中經(jīng)機體血液轉(zhuǎn)移到乳汁中[26]。

3.2 圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學信息素芻議

用HS-SPME-GC-MS法從圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測定出的有機化學物質(zhì)和香氣成分都有揮發(fā)的物理特性,不但可在空氣中向外擴散,而且香氣成分還有不同韻調(diào)、不同強度的香氣,可向幼仔傳遞某些信息,因此圈養(yǎng)大熊貓乳汁的香氣具備化學信息素的功能,稱之為乳源性化學信息素。表9中選列出的呈香物質(zhì)多為調(diào)香師常用的單體香原料，我們的調(diào)香實踐證實，即使呈香物質(zhì)數(shù)量相同,只要有1種呈香物質(zhì)添加量不一樣,香氣就有一定程度的差異,甚至香型發(fā)生改變。圈養(yǎng)大熊貓乳汁中如此多的呈香物質(zhì)再加上每種呈香物質(zhì)的含量變化可組編出很多種不同韻調(diào)的香氣,形成不同個體、不同年齡、不同泌乳階段的個性化香氣或特征性香氣。據(jù)此認為圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學信息素并非簡單的1種呈香物質(zhì),而是由多種揮發(fā)性呈香物質(zhì)組成的,以某種香氣形式供幼仔憑借日益發(fā)育成熟的嗅覺來感知和識別,達到遺留標記或傳遞某種信息的目的。大熊貓成體的視力較差[27],幼體的嗅覺發(fā)育早于聽覺和視覺[28],由于幼仔熟悉了各自母親的乳汁氣味,才有可能發(fā)生“各找各媽”的母子之間互動現(xiàn)象。乳源性化學信息素除標記自己的幼仔和哺乳地點外,主要作用是激發(fā)幼仔采食欲望,吸引幼仔前去吸乳,或許還有其他未被人們知曉的功效。

3.3 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs測試結(jié)果影響因素

因圈養(yǎng)大熊貓乳汁的稀缺性,難以采得大量乳樣進行多方法多途徑探究其香氣成分,如有機溶劑蒸餾提取法需乳量較多,故采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法測試圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs是切實可行的，能探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分，上述的測試結(jié)果也證實了該方法的可靠性。但不同的SPME溫度和時長、SPME型號、GC-MS聯(lián)用儀生產(chǎn)廠家和新舊程度、程序升溫、解吸時間長短、毛細管柱類型和長度、譜庫是否最新版本、自動檢索還是人工檢索,都會有不同的結(jié)果,且圈養(yǎng)大熊貓哺乳母獸的日糧構(gòu)成、泌乳階段、健康狀況、年齡、遺傳因素等自身條件,采集樣品時的氣溫等環(huán)境因子也是重要影響因素。嗅感圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣較強時,測試效果較好,這在圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”乳汁的測試結(jié)果(表8)得到佐證。本文是按照表2方法取得的結(jié)果,但我們相信圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs遠不止這些成分。由于此前未見國內(nèi)外有關圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs和香氣成分方面的報道,我們僅在這方面進行了首次探索性研究,可供以后分析圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs和探究圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學信息素參考。

3.4 圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成分的應用意義

圈養(yǎng)大熊貓乳汁氣味具有獨特性,在特征性香氣方面有別于牛乳、羊乳等哺乳動物的乳汁。若用其它動物乳汁或奶粉補飼或全飼大熊貓幼仔,因風味差異,缺少母乳的特有香氣,幼仔不熟悉這些乳汁或奶粉的氣味,會造成一段時間不愿采食,影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝入,導致生長發(fā)育減緩甚至健康水平下降。可根據(jù)圈養(yǎng)大熊貓乳汁的風味特征[19]和上述測出的香氣成分,模擬圈養(yǎng)大熊貓乳汁的天然香氣,調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑,讓人工乳、代用奶、窩窩頭等食物具有“媽媽”的乳味,使幼仔采食過程具有安全感、親切感和幸福感,緩解從自然母乳向人工食物變換而引起的應激反應,增強幼仔采食欲望。圈養(yǎng)大熊貓幼仔專用誘食劑在本質(zhì)上就是人工仿制的大熊貓乳源性化學信息素，遵照圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的共同特點，采用多種香原料調(diào)制而成，以某種強度的母乳樣香氣賦予大熊貓幼仔的人工食物，吸引幼仔采食，便于人工乳和代用奶的平穩(wěn)使用，利于幼仔食物由液態(tài)向固態(tài)的漸進過渡，也有助于破解大熊貓幼仔的化學生態(tài)覓食效應之謎。

本研究結(jié)果不僅為圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的形成找到了部分直接物質(zhì),也為研制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專用誘食劑提供了部分原料選擇的依據(jù)。表9所列46種單體呈香物質(zhì)中有5種是我國食品安全國家標準----食品添加劑使用標準(GB 2760-2014)中不允許使用的，分別是2-甲基-3-丁烯-2-醇、順式-2-戊烯-1-醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、乙醇、3-己烯-1-醇,因此在調(diào)制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專用誘食劑時應規(guī)避使用上述5種呈香物質(zhì),其余41種均可作為單體香原料，在嚴格遵守國家有關規(guī)定的前提下酌情酌量選用。

(致謝:本研究的實施過程中,中國大熊貓保護研究中心的有關領導和科研動管處黃炎教授級高級工程師、屈元元工程師在批準采集乳樣時給予了支持,臥龍神樹坪基地的董超、楊長江、曾文、程建斌等同仁在乳樣采集時熱情相助,四川大學分析測試中心的丁小東副研究員、中國科學院成都分院分析測試中心的胡靜副研究員、農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所的周正工程師在成分分析和推定方面提供了幫助,在此一并深表謝意！)