枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備玉米肽-葡萄糖螯合物的條件優(yōu)化

劉 奇 張 智

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

目前我國玉米主要用于工業(yè)發(fā)酵制備酒精、生產(chǎn)玉米糖漿和淀粉。玉米在深加工生產(chǎn)玉米淀粉時(shí)會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——玉米蛋白，該副產(chǎn)物硬度高、水溶性差，因此常被做為飼料廉價(jià)銷售或丟棄，浪費(fèi)資源的同時(shí)造成環(huán)境的污染[1]。

玉米肽是一種由玉米蛋白經(jīng)水解后，通過肽鍵將氨基酸以不同的排列方式連接而成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物功能活性的短肽聚合物[2-3]。研究表明玉米肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶[4]、降低血壓[5]、促進(jìn)乙醇代謝、醒酒護(hù)肝[6]以及抗氧化[7-12]、緩解疲勞[13]、抗癌[14]等功能。越來越多的植物蛋白肽被廣泛應(yīng)用于幼兒輔食、功能保健食品中[15-21]。

常用的制備玉米活性肽的方法有酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法[22]。微生物發(fā)酵法制備玉米肽可降低肽的苦味和抗?fàn)I養(yǎng)因子，簡化生產(chǎn)工藝的同時(shí)降低生產(chǎn)成本[23]等特點(diǎn)。螯合是一種高新技術(shù)，玉米肽-葡萄糖螯合物是通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的胞外酶將葡萄糖鑲嵌在兩個(gè)肽分子之間的一種穩(wěn)定的連接形式，在提高肽穩(wěn)定性的同時(shí)，提高其功能活性和適口性。張智[24]等利用玉米肽與鋅、香菇多糖鍵合制備玉米肽與鋅、香菇多糖的螯合物，發(fā)現(xiàn)該螯合物能顯著(P<0.05)提高小鼠的非特異性免疫等功能，但由于鋅、香菇多糖的成本相對較高，若能利用微生物發(fā)酵法將玉米肽與成本相對較低的葡萄糖螯合，制成功能活性肽應(yīng)用于新資源食品領(lǐng)域的開發(fā)中，既可改善產(chǎn)品的適口性、提高玉米肽的化學(xué)穩(wěn)定性及生物學(xué)效價(jià)，又可在節(jié)約資源的同時(shí)提高玉米副產(chǎn)物的附加值，實(shí)現(xiàn)糧食作物長久可持續(xù)發(fā)展。

本研究以玉米肽和葡萄糖為底物，通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出微生物發(fā)酵(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45)制備玉米肽-葡萄糖螯合物的最優(yōu)條件，為后續(xù)研究玉米肽-葡萄糖螯合物體內(nèi)、體外抗氧化活性提供數(shù)據(jù)支持，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)玉米肽系列功能產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.5%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.2%。

玉米肽；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45；蛋白胨；酵母膏；葡萄糖；DPPH。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計(jì)；TU-1810紫外分光光度計(jì)；5030-PVL程控壓力蒸汽滅菌器；SW―CJ―IFD超凈臺；AR2140型分析天平；S220型pH計(jì)；ZD-85雙功能氣浴恒溫振蕩器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法

將玉米肽(通過Sephadex G-25分級得到肽段(平均分子質(zhì)量為572 u，肽含量為75.83%))配制成底物濃度為4%的溶液，調(diào)節(jié)pH值至7；取50 mL玉米肽溶液，按投料比為8∶1的比例加入葡萄糖供體，再次調(diào)節(jié)pH值至7；121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫；在無菌條件下接入枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行發(fā)酵；得到的發(fā)酵液再次滅菌，冷卻后4 500 r/min離心10 min；流水透析24 h，過濾后冷凍干燥得到最終玉米肽-葡萄糖螯合物。組分中玉米肽及葡萄糖的含量相對較高，所占比例為80.05%；玉米肽-葡萄糖螯合率為69.58%。

1.3.2 DPPH清除率的計(jì)算

將玉米肽-葡萄糖螯合物配制成3 mg/mL的樣液備用，用95%的乙醇溶解DPPH粉末，配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液。取待測樣品溶液和DPPH各2 mL混勻，室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測吸光度值，記為OD1；對照組用95%的乙醇代替DPPH溶液，同樣條件下室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測吸光度值，記為OD2；空白組用蒸餾水代替樣液，于517 nm處測定吸光值，記為OD0。

(1)

式中：OD1為樣液加DPPH溶液的吸光度值；OD2為樣液加乙醇溶液的吸光度值；OD0為乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化玉米肽-葡萄糖螯合條件

以接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH 4個(gè)因素研究不同發(fā)酵條件對玉米肽-葡萄糖螯合DPPH清除率的影響，并分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3.1 接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%和14%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵液pH值6，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.3.2 發(fā)酵時(shí)間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72、84 h，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵液pH值6，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，枯草芽孢桿菌接種量12%，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察時(shí)間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.3.3 發(fā)酵溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃，枯草芽孢桿菌接種量12%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵液pH值6，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.2.4 pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取pH值分別為5、5.5、6、6.5、7和7.5，枯草芽孢桿菌接種量12%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過Design Expert 8.0.6軟件，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，針對接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH進(jìn)一步設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以DPPH清除率為指標(biāo)，從而得出發(fā)酵最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Excel軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 單因素條件確定

由圖1接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，接種量從4%增加至10%時(shí)，DPPH清除率也隨之從4.60%增加到38.00%，這可能由于接種量增加，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵作用使玉米肽能更充分地與葡萄糖結(jié)合，形成具有功能活性的玉米肽-葡萄糖螯合物。當(dāng)接種量從10%增加至14%，清除率又開始下降，這可能是由于底物濃度一定，隨著接種量的增加，底物逐漸被消耗的同時(shí)也使得所合成的玉米肽-葡萄糖螯合物被消耗，故其DPPH清除率呈下降趨勢。

圖1 接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH值對DPPH清除率的影響

由pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，在pH 5到pH 6之間，玉米肽-葡萄糖螯合物玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率逐漸升高，在pH為6時(shí)DPPH清除率達(dá)到最大83.08%。而從pH 6到pH 7.5，DPPH清除率開始呈減小趨勢。在pH<6時(shí)供體DPPH清除率隨pH增大而逐漸升高，說明在偏酸性環(huán)境下，玉米肽-葡萄糖螯合物抗氧化能力較好。

由發(fā)酵時(shí)間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可以看出隨發(fā)酵時(shí)間的延長，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率呈先升高后降低的趨勢。發(fā)酵48 h時(shí)玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率從35.38%升高到80.47%。發(fā)酵48 h到84 h，隨發(fā)酵時(shí)間延長玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率反而降低。這是由于在葡萄糖和玉米肽底物一定的情況下，隨發(fā)酵時(shí)間延長，枯草芽孢桿菌將底物消耗的同時(shí)，也消耗了部分玉米肽-葡萄糖螯合物導(dǎo)致其DPPH清除率降低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)酵48 h為一個(gè)周期。

由發(fā)酵溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，發(fā)酵溫度在25～35 ℃時(shí)玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率隨發(fā)酵溫度升高而升高，35～50 ℃時(shí)隨發(fā)酵溫度升高，供體DPPH清除率降低，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)DPPH清除率最高。由此可知35 ℃為枯草芽孢桿菌發(fā)酵的最適溫度。溫度從35 ℃變化至50 ℃，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率隨溫度升高而降低，其原因可能為溫度過高破壞了酶活，同時(shí)使玉米肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化，功能肽段部分被破壞甚至水解，無法發(fā)揮其作用。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH對玉米肽-葡萄糖螯合物的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

如表2所示，采用Box-Be hnken模型，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中4個(gè)因子分別為A接種量(%)、B發(fā)酵時(shí)間(h)、C pH、D發(fā)酵溫度( ℃)，以玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率作為響應(yīng)值。

微生物法修飾玉米肽的回歸方程為：

y=+90.35+1.04A-0.54B+0.36C+1.86D+0.34AB-0.33AC-0.47AD+0.24BC-0.80BD+0.41CD-2.86A2-3.76B2-4.51C2-2.54D2

公式中y為響應(yīng)值，A、B、C、D分別為對應(yīng)的響應(yīng)值。由公式可以看出擬合出的回歸方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，因此實(shí)驗(yàn)中建立的模型的拋物面開口是向下的，即響應(yīng)值存在最大值。

2.2.2 回歸方程的方差分析

應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0.6，根據(jù)中心響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)原理對表3中DPPH清除率數(shù)據(jù)處理，方差分析結(jié)果如表3。

表3 回歸模型方差分析表

注:P<0.01，極顯著，**；P<0.05，顯著，*。

由表3可以看出P<0.000 1表明該模型極顯著，R2為97.12%，調(diào)整R2為96.96%，說明擬合的方程較好。通過F值看出，試驗(yàn)中各因素對DPPH清除率的影響大小順序?yàn)椋篋>A>B>C，即發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時(shí)間>pH。所有二次項(xiàng)差異顯著，其他項(xiàng)不顯著。利用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米肽-葡萄糖螯合物條件為：接種量10.28%，發(fā)酵時(shí)間46.80 h，pH 6.05，發(fā)酵溫度36.85 ℃，此時(shí)DPPH清除率理論值為90.34%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從實(shí)際操作的角度考慮，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取的發(fā)酵條件為接種量10%，發(fā)酵時(shí)間46 h，pH 6，發(fā)酵溫度37 ℃，該條件下實(shí)測值為90.82%，與理論值相差0.48%，故此條件為發(fā)酵的最佳工藝條件。

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出枯草芽孢桿菌優(yōu)化玉米肽-葡萄糖螯合物的最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量10%，發(fā)酵時(shí)間46 h，pH 6，發(fā)酵溫度37 ℃，此時(shí)DPPH清除率為90.82%。此研究彌補(bǔ)了利用微生物發(fā)酵法制備玉米肽-葡萄糖螯合物的空缺，提高玉米加工副產(chǎn)物附加值的同時(shí)，為后續(xù)研究該玉米肽-葡萄糖螯合物體內(nèi)、體外抗氧化及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。