田少楠，劉思佳，王拓一

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

大白菜是十字花科蕓薹屬蔬菜作物，原產(chǎn)于我國(guó)，同時(shí)兼?zhèn)涫秤脙r(jià)值與藥用價(jià)值[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)大白菜秋播面積約165 萬hm2，居各類蔬菜之首，是最重要的“秋儲(chǔ)菜”品種之一。近年來的研究表明，大白菜貯藏過程中損失較大，尤其是營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味損失嚴(yán)重[2]。

有學(xué)者前期對(duì)貯藏過程中的大白菜基因表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)LIP2和LOX2是脂肪代謝過程中的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因。LIP2基因是從脂溶性酵母Yarrowialipolytica中分離得到的[3]，其脂肪酶LIP2是一種優(yōu)良的脂肪酶，有很高的酯化、水解、轉(zhuǎn)酯活性[4]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）也稱為氧合酶，即亞油酸氧化還原酶，是植物十八碳酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，廣泛存在于高等植物與動(dòng)物體內(nèi)，與種子的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老等植物生化、生理密切相關(guān)[5-6]。LOX2是植物脂氧合酶多基因家族成員[7-8]。LIP2和LOX2在大白菜貯藏過程中的生理功能尚不明確。因此，開展LIP2和LOX2大白菜貯藏過程中生理功能的研究，旨在提高大白菜在貯藏過程中的品質(zhì)，同時(shí)為大白菜貯藏方式的選擇提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜：購(gòu)于黑龍江省齊齊哈爾市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

試劑：Trizol、三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇、鹽酸、石油醚（30～60 ℃沸程）、DEPC 處理水、DNAmarker，6×loading buffer、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRT reagent Kit、瓊脂糖、Super GelRed、50×TAE 緩沖溶液、qRT-PCR 引物。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-10C 電泳儀，北京市六一儀器廠；CFX96 Real-Time PCR 儀，Bio-Rad 公司；BS-223-S 電子分析天平，常州潤(rùn)華電器有限公司；TD5Z 冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；P70D20TJ-D3 微波爐，格蘭仕微波爐電器郵箱公司；WD-9403C 紫外分析儀，北京市六一儀器廠；HH-S 型水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；101-1-BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大白菜葉、根的總RNA 提取

稱取0.1 g 大白菜葉組織和根組織放入1.5 mL RNase-free EP 管中，分別在兩支EP 管中加入0.5 mL Trizol 試劑，冰上進(jìn)行研磨后，按照Trizol 試劑盒提取RNA 步驟進(jìn)行分離提取，70%乙醇洗滌后離心得到RNA，室溫干燥沉淀；加入20 μL DEPC 處理水溶解，取1 μL RNA 樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外分光光度測(cè)量RNA 濃度，并于-80 ℃進(jìn)行保存。

1.3.2 cDNA 的合成

根據(jù)5×PrimeScript RT Master Mix 6 μL、RNA 4 μL、ddH2O 10 μL 配置20 μL 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系；混合均勻后離心，反應(yīng)條件為37 ℃、30 min，85 ℃、5 s，4 ℃無限循環(huán)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40 個(gè)；反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 稀釋10 倍使用。

1.3.3 Real-time qPCR 分析

用Real-time qPCR 檢測(cè)大白菜葉部和根部差異表達(dá)mRNA 的表達(dá)量。反應(yīng)體系包括5 μL TB-Green、0.5 μL PCR Forward Primer（10 μmol）、0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、3 μL ddH2O、1 μL 樣品cDNA，構(gòu)成總體積為10 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，40 個(gè)PCR 循環(huán)，采用默認(rèn)設(shè)置自動(dòng)生成Ct值。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，用相對(duì)定量2-ΔΔCt 法計(jì)算分析基因的表達(dá)水平。

1.3.4 基因引物序列

基因序列來自brassicadb.org，并利用NCBI-BLAST進(jìn)行對(duì)比?；蛞镄蛄蝎@取自https：//biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/primers，并利用NCBI-Primer-BLAST 進(jìn)行驗(yàn)證[9]，見表1。

1.3.5 大白菜脂肪提取

參考GB 5009.6-85 對(duì)食品脂肪的檢驗(yàn)方法，選擇酸水解法，并根據(jù)郭盛斌[10]的改進(jìn)方法進(jìn)行操作。稱取樣品約2 g 于50 mL 大試管中，對(duì)樣品進(jìn)行酸水解、脂肪提取，依據(jù)公式計(jì)算出脂肪含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜中脂肪代謝基因在光照與黑暗條件下的表達(dá)

2.1.1 大白菜中LIP2基因在光照與黑暗條件下的表達(dá)

如圖1、圖2 所示，大白菜葉部和根部LIP2基因mRNA 表達(dá)量在黑暗條件下均隨貯藏時(shí)間的增加而增加，并且在脂肪含量測(cè)定中葉部在光照和黑暗條件下隨貯藏時(shí)間增加而下降，僅根部在黑暗條件下增加。由此，可以推斷LIP2基因在貯藏過程中可能具有脂肪代謝作用。王景樂[11]研究也指出，LIP2基因?qū)τ谥铣?、脂水解、脂交換等均具有重要的催化作用，這與本研究的結(jié)果一致。

表1 引物序列表Table 1 List of primers

圖1 大白菜LIP2 基因葉部在光照和黑暗條件下的表達(dá)Fig.1 The expression of LIP2 gene in leaves under light and night condition in Chinese cabbage

圖2 大白菜LIP2 基因根部在光照和黑暗條件下的表達(dá)Fig.2 The expression of LIP2 gene in roots under light and night condition in Chinese cabbage

2.1.2 大白菜中LOX2基因在光照與黑暗條件下的表達(dá)

如圖3、4 所示，大白菜在貯藏過程中葉部和根部的LOX2基因mRNA 表達(dá)量在黑暗條件下比在光照條件下高，且隨貯藏時(shí)間增加而增加。在脂肪含量測(cè)定過程中，葉部和根部的脂肪含量處于下降趨勢(shì)。因此，可以推斷LOX2基因在貯藏過程中對(duì)脂肪起到了一定的代謝作用。同時(shí)，有研究表明，LOX表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞膜功能紊亂，通過多不飽和脂肪酸的過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞破壞，并且LOX可能參與乙烯刺激和生產(chǎn)的反饋回路，從而促進(jìn)成熟過程[12-13]。ERIN BELL 等[14]的研究表明，LOX的同工酶主要在葉片以外的組織中表達(dá)，這與本研究結(jié)果較為一致。由此，可以推斷大白菜LOX2基因可能為其脂肪代謝基因。

圖3 大白菜LOX2 基因葉部在光照和黑暗條件下的表達(dá)Fig.3 The expression of LOX2 gene in leaves under light and night condition in Chinese cabbage

圖4 大白菜LOX2 基因根部在光照和黑暗條件下的表達(dá)Fig.4 The expression of LOX2 gene in roots under light and night condition in Chinese cabbage

2.2 大白菜在光照和黑暗條件下貯藏過程中的脂肪含量

圖5（見下頁）為大白菜葉部與根部在光照和黑暗條件下脂肪含量的表達(dá)。根據(jù)基因表達(dá)差異分析，可以得出在光照貯藏條件下，葉部P=0.011 835（圖5A），根部P=0.749 379（圖5B），大白菜葉部脂肪含量隨貯藏時(shí)間的增加而下降的趨勢(shì)明顯，而在黑暗貯藏條件下，葉部P=0.441 014（圖5C），根部P=0.663 504（圖5D），大白菜葉部和根部的脂肪含量隨貯藏時(shí)間的增加均表現(xiàn)不顯著。這與我們所做脂肪代謝基因所得到的結(jié)論一致。由此，我們認(rèn)為在貯藏過程中光照會(huì)對(duì)脂肪代謝產(chǎn)生影響。郭兵等[15]研究也表明，過低和過高的光照強(qiáng)度都不利于不飽和脂肪酸的積累，適宜的光照可以對(duì)植物的脂肪含量產(chǎn)生影響，這與本研究結(jié)果一致。

圖5 大白菜葉部與根部在光照和黑暗條件下脂肪含量的表達(dá)Fig.5 Expression of Chinese cabbage leaves and roots under light and night conditions

2.3 目標(biāo)基因表達(dá)的差異性

表2 目標(biāo)基因差異表達(dá)Table 2 Differential gene expression

由表2 可知，對(duì)貯藏過程中大白菜基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)LIP2和LOX2隨貯藏時(shí)間的增加，呈現(xiàn)差異表達(dá)。

3 結(jié)論

通過以上研究，我們可以得出LIP2和LOX2在大白菜貯藏過程中均對(duì)脂肪起到代謝作用，并且在對(duì)貯藏過程中大白菜基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)LIP2和LOX2隨貯藏時(shí)間的增加，呈現(xiàn)差異表達(dá)。利用光照對(duì)大白菜進(jìn)行貯藏，調(diào)控脂肪代謝基因，能減少大白菜中脂肪的流失，提高大白菜在貯藏過程中的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究還發(fā)現(xiàn)，可以認(rèn)為在大白菜貯藏方式上給予光照處理，可以起到延長(zhǎng)大白菜貨架期的效果。