張超越，李海剛，辛杰，張桂芝，王守箐，劉林

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005）

單寧是植物次生代謝產(chǎn)物[1-3]，可分為水解性與非水解性兩種類型[4-7]，前者分子量較小，可發(fā)生水解反應(yīng)[6-7]，后者分子量較大，不發(fā)生水解反應(yīng)[8-9]。單寧是一類生物活性分子，具有抗氧化、殺菌、抑制腫瘤、保護(hù)心血管等作用，在食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域都有開發(fā)應(yīng)用[10-14]。葡萄酒具有抗氧化活性就是因?yàn)樗袉螌?，單寧是葡萄種皮、果皮或果柄發(fā)酵過程中釋放到酒里的，或是貯藏于橡木桶中的酒從橡木中萃取的[10]。因此，研究植物單寧積累的特征不僅具有植物學(xué)理論意義，也能為植物單寧開發(fā)應(yīng)用提供參考。

柿果實(shí)分為澀柿和甜柿兩種類型[15]，澀柿積累大量單寧，成熟軟化前食用口感極差，必須經(jīng)自然光照或通過化學(xué)藥品等措施使單寧變性，澀味才能大大減輕或消失。定量檢測(cè)表明甜柿含少量單寧[15]，但對(duì)單寧在果實(shí)中的積累特征還缺少顯微觀察。為了解甜柿果實(shí)中單寧在什么類型組織中積累，所在的積累細(xì)胞以及在細(xì)胞的積累空間，本研究用組織化學(xué)方法和透射電子顯微技術(shù)對(duì)甜柿果實(shí)中的單寧積累進(jìn)行了顯微分析。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物柿（Diospyros kaki）為甜柿，品種為富有，栽種于臨沂大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地。為避免果實(shí)成熟后單寧已經(jīng)發(fā)生自然變性而不易進(jìn)行顯微檢測(cè)，于8 月中旬取未成熟果實(shí)進(jìn)行單寧積累特征的顯微分析。選3 個(gè)地點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)選3 棵樹，從每棵樹上隨機(jī)取6 個(gè)果實(shí)。

1.2 透射電子顯微技術(shù)

具有鄰位二羥基的酚類化合物與四氧化鋨強(qiáng)烈反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的絡(luò)合物，在透射電子顯微下呈現(xiàn)出高電子密度[16-17]。從未成熟的柿果實(shí)上取小于1 mm3的小塊，用2.5%戊二醛溶液（用0.05 mol 磷酸緩沖液配制）固定12 h，再用1%四氧化鋨溶液固定4 h，酒精脫水，Epon-812 樹脂包埋，切片，厚度為60 nm，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，透射電鏡下觀察單寧。

1.3 組織化學(xué)法

單寧與四氧化鋨反應(yīng)，產(chǎn)物在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)棕色至黑色[17-18]。將柿果肉小塊固定后在四氧化鋨溶液中浸泡4 h，之后包埋于樹脂中，切片，厚度1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

利用單寧與三氯化鐵反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)綠色的性質(zhì)，從未成熟果實(shí)上取果肉，用戊二醛溶液固定后在三氯化鐵溶液中浸泡12 h，然后包埋于樹脂中，切片，厚度1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿果實(shí)顯微特征

柿果實(shí)肉質(zhì)，為漿果。果肉由維管組織和貯藏組織組成，具體見圖1A～D，維管組織沒有維管束鞘包圍，由木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成，韌皮部較發(fā)達(dá)，占比較多，而木質(zhì)部相對(duì)較小，占比較少。圖1A、B、D 顯示，維管組織細(xì)胞排列緊密，沒有細(xì)胞間隙，細(xì)胞較小，長(zhǎng)5～20 μm，寬3～15 μm，外圍的細(xì)胞較大，內(nèi)部的細(xì)胞較??；木質(zhì)部細(xì)胞較大，韌皮部細(xì)胞較小。

與維管組織相比，貯藏組織細(xì)胞排列較疏松，細(xì)胞間隙較明顯，細(xì)胞體積較大，但不同位置的細(xì)胞大小有明顯差異，靠近維管組織的細(xì)胞較小，長(zhǎng)50～70 μm，寬40～50 μm；遠(yuǎn)離維管組織的細(xì)胞較大，長(zhǎng)80～160 μm，寬60～100 μm（圖1A～D）。

貯藏組織細(xì)胞高度液泡化，液泡占據(jù)細(xì)胞絕大部分空間（圖1A～D）。維管組織中較大的細(xì)胞高度液泡化（圖1A～D），較小的細(xì)胞液泡化程度低，含有較多細(xì)胞質(zhì)（圖1E、F）。

2.2 果肉中單寧的積累特征

2.2.1 貯藏組織中的單寧積累

基于四氧化鋨和三氯化鐵鑒定分析，貯藏組織中約有4%的細(xì)胞積累單寧，單寧幾乎充滿細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)極少。圖1A、C、D 顯示積累單寧的細(xì)胞出現(xiàn)在維管束周圍，或在遠(yuǎn)離維管束的位置。細(xì)胞中的單寧在液泡內(nèi)積累，不會(huì)向周圍細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖1B、C 顯示，單寧不僅在細(xì)胞中積累，也在貯藏組織細(xì)胞間隙積累，充滿局部區(qū)域的細(xì)胞間隙。通常是維管束韌皮部一側(cè)的貯藏組織細(xì)胞間隙積累單寧，而木質(zhì)部一側(cè)的貯藏組織細(xì)胞間隙少有單寧積累，顯示貯藏組織細(xì)胞間隙單寧積累與韌皮部密切相關(guān)。果實(shí)韌皮部是來自光合器官同化物向貯藏組織卸載的場(chǎng)所，與韌皮部相鄰的貯藏細(xì)胞優(yōu)先獲得光合同化物。

2.2.2 維管組織中的單寧積累

維管組織多數(shù)細(xì)胞不積累單寧，只有很少數(shù)維管薄壁細(xì)胞積累單寧，單寧細(xì)胞約占維管組織細(xì)胞總數(shù)的5%（圖1B、D、E）。多數(shù)維管束橫切面上可見單寧細(xì)胞，2個(gè)或4 個(gè)聚集在一起（圖1A、B），但個(gè)別維管束橫切面上不出現(xiàn)單寧細(xì)胞（圖1D）。單寧在中央大液泡內(nèi)積累，充滿單寧細(xì)胞內(nèi)部空間，細(xì)胞質(zhì)極少。與單寧細(xì)胞相鄰的維管薄壁細(xì)胞不積累單寧（圖1F），表明單寧被限制在液泡內(nèi)，不會(huì)從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)散。維管組織沒有細(xì)胞間隙，不發(fā)生細(xì)胞間隙單寧積累。

圖1 甜柿果肉中單寧的積累Fig.1 Tannin accumulation in non-astringent persimmon fruits

3 討論

本研究分析了甜柿果實(shí)中單寧積累特點(diǎn)，結(jié)果顯示，其既在葉肉組織少部分細(xì)胞中積累，也在維管組織少部分細(xì)胞中積累；既在細(xì)胞內(nèi)部的液泡中積累，也在細(xì)胞細(xì)胞外部即細(xì)胞間隙中積累。該研究結(jié)果揭示了甜柿果實(shí)中單寧積累的特征，從顯微水平上證實(shí)了甜柿仍然含有少量單寧，與用吸收光譜和色譜分析等技術(shù)手段的研究結(jié)果一致[15]。

細(xì)胞內(nèi)部合成單寧的場(chǎng)所是單寧體[19]，單寧體是一種起源于葉綠體類囊體膜的細(xì)胞器，單寧合成后轉(zhuǎn)移到液泡。但單寧體并不是單寧合成的唯一場(chǎng)所，有研究用抗五沒食子酰葡萄糖抗體和抗沒食子轉(zhuǎn)移酶的抗體進(jìn)行免疫定位，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁上存在這種酶的活性[7]，這種酶是水解性單寧合成所需要的酶，由此證明細(xì)胞壁也是單寧合成的場(chǎng)所，葡萄糖和沒食子酸由細(xì)胞分泌到細(xì)胞壁中并在那里合成單寧。甜柿單寧既在液泡內(nèi)積累，也在細(xì)胞間隙積累，液泡和細(xì)胞間隙是完全不同的環(huán)境。細(xì)胞間隙是細(xì)胞外空間，這里的單寧由細(xì)胞中的單寧體合成并分泌而來，或者在細(xì)胞壁中合成并擴(kuò)散出來，但要證明其準(zhǔn)確來源尚需要更多研究。