山羊MC4R基因多態(tài)性與體質(zhì)量性狀的關(guān)聯(lián)性分析

張俊　李隱俠　錢勇　王慧利　孟春花　曹少先

摘要：為探討黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因多態(tài)性對山羊體質(zhì)量的影響，以波爾山羊?yàn)檠芯繉ο?，采用池DNA為模板，PCR擴(kuò)增MC4R基因，Sanger測序法篩選其在波爾山羊中的SNPs位點(diǎn)，PCR-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)分型，單因素方差分析不同基因型間波爾山羊各月齡體質(zhì)量的差異。結(jié)果表明，編碼區(qū)502 bp處新檢測到A/G單堿基顛換，位于BseJⅠ酶切位點(diǎn)內(nèi)，在波爾山羊群體中存在AA（0.779 1）、AG（0.202 5）和GG（0.018 4）3種基因型，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AA基因型個(gè)體初生體質(zhì)量、1周齡體質(zhì)量顯著高于AG基因型（P<0.05），1周齡體質(zhì)量極顯著高于GG基因型（P<0.01），2周齡、2月齡、3月齡體質(zhì)量顯著高于GG型（P<0.05）。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，A502G、C693T、A946C和C986T位點(diǎn)共存在8種不同的基因型組合，AACCAACC型個(gè)體初生體質(zhì)量顯著高于AGCCAACC型（P<0.05），AACCAACT型個(gè)體周歲體質(zhì)量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型（P<0.05）。綜上所述，MC4R基因的A502G位點(diǎn)A基因?qū)ι窖蛟缙隗w質(zhì)量增加更有利，基因型組合AACCAACT對山羊周歲體質(zhì)量增加更有利，可以作為山羊生長性狀選擇的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：山羊;黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）;多態(tài)性;體質(zhì)量性狀;關(guān)聯(lián)性分析

中圖分類號： S827.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0053-04

收稿日期：2018-08-07

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（編號：PZCZ201740）;江蘇省肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位項(xiàng)目（編號：SXGC[2017]262）;國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2018YFD0501902-03）。

作者簡介：張 俊（1982—），女，江蘇南京人，助理研究員，主要從事羊分子育種研究。E-mail：applepuding@163.com。

通信作者：曹少先，博士，研究員，主要從事動物遺傳資源與育種研究。Tel：（025）84390352;E-mail：sxcao@jaas.ac.cn。

黑素皮質(zhì)素受體-4（melanocortin receptor-4，MC4R）是動物下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)[1]，是黑素皮質(zhì)素受體家族5個(gè)亞型之一，它屬于G蛋白偶聯(lián)受體超級家族，為跨膜神經(jīng)受體。在哺乳動物中，MC4R具有介導(dǎo)瘦素（leptin）的功能，是一個(gè)調(diào)節(jié)能量動態(tài)平衡的重要信號分子[2]。MC4R通過與其內(nèi)源性配體黑素皮質(zhì)素激素（melanocortin，MC）或刺鼠色蛋白（agouti protein，agouti蛋白）及其相關(guān)蛋白（agouti related protein，AGRP）相結(jié)合，從而在控制食欲和體質(zhì)量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[3-4]。1993年，Gantz等首次克隆出人MC4R基因，并用熒光標(biāo)記原位雜交法將其定位于人18號染色體上[5]。1997年，Huszar等首次利用基因敲除試驗(yàn)證明了MC4R基因缺失的小鼠出現(xiàn)肥胖、多食、胰島素分泌過多等癥狀，提出了MC4R基因在采食量和能量平衡中具有重要作用[6]。此后，又有研究發(fā)現(xiàn)，MC4R對豬、牛、兔等家畜的背膘厚、日增質(zhì)量和采食量等有重要影響，可作為選擇動物生長性狀的候選遺傳標(biāo)記。

張俊等的研究發(fā)現(xiàn)，波爾山羊MC4R基因存在C693T、A946C、C986T等3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中在C693T、A946C處分別檢測到CC、CT和AA、AC各2種基因型，不同基因型波爾山羊體質(zhì)量差異不顯著;C986T處檢測到CC、CT和TT等3種基因型，CT型的6月齡體質(zhì)量和日增質(zhì)量均極顯著高于CC型，CT型的周歲體質(zhì)量和日增質(zhì)量均顯著高于CC型，表明MC4R基因C986T位點(diǎn)可以作為山羊體質(zhì)量性狀標(biāo)記輔助選擇的候選分子標(biāo)記[7-8]。

目前，關(guān)于山羊MC4R基因多態(tài)性及與其生長性狀關(guān)系的研究仍然較少，是否存在新的影響山羊生長性狀的MC4R位點(diǎn)，以及已發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)基因型組合是否影響生長性狀等均有待進(jìn)一步研究。為此，本研究對山羊MC4R基因重新進(jìn)行測序，尋找多態(tài)性位點(diǎn)，分析其多態(tài)性與山羊體質(zhì)量性狀的關(guān)聯(lián)，聯(lián)合前期報(bào)道的3個(gè)位點(diǎn)，分析基因型組合與山羊體質(zhì)量性狀的關(guān)聯(lián)，為山羊生長性狀的分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于本研究的163只波爾山羊及其體質(zhì)量資料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物試驗(yàn)基地提供。每只個(gè)體取耳組織樣于凍存管中，置冰桶中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織DNA提取

采用酚-三氯甲烷抽提法提取組織樣DNA[9]，并溶于TE Buffer中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MC4R基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中山羊MC4R序列（NM_001285591.1）設(shè)計(jì)引物。上游引物序列為5′-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3′，下游引物序列為5′-CTGGGCACTGCTTCACATC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段1 375 bp。PCR反應(yīng)總體系20 μL，包含模板DNA 60 ng、10×緩沖液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.4 突變位點(diǎn)測序篩選

將40只波爾山羊隨機(jī)分成4組（n=10），每組10只個(gè)體的DNA等量混合構(gòu)建DNA池，每個(gè)DNA池取60 ng為模板進(jìn)行MC4R基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用寶生物工程（大連）有限公司試劑盒切膠回收純化后，送上海英駿生物技術(shù)公司測序。

1.5 PCR-RFLP分析

1.5.1 MC4R基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)1對引物擴(kuò)增MC4R基因758 bp片段（NM_001285591.1，序列 379～1 136 bp），該片段包含A502G突變位點(diǎn)，基因型A位于BseJⅠ識別序列內(nèi)。上游引物序列為5′-[JP9]AATCCAAGATGAACTCTACCCA-3′，下游引物序列為5′-[JP9]CAGGATGGTCAGCGTGAT-3′。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，含模板DNA 60 ng、10×緩沖液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.5.2 基因型的確定 采用BseJⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系16 μL，含PCR產(chǎn)物5 μL、BseJⅠ（10 U/μL）0.5 μL、10×緩沖液1.6 μL、滅菌雙蒸水8.9 μL，37 ℃酶切3 h。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB染色，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行成像分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件one-way ANOVA分析基因型、基因型組合間波爾山羊各月齡體質(zhì)量差異。各月齡體質(zhì)量以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC4R基因的擴(kuò)增

對4組波爾山羊池DNA模板分別進(jìn)行MC4R基因PCR擴(kuò)增，在1 400 bp左右得到1條特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 測序篩選多態(tài)位點(diǎn)

以4組波爾山羊池DNA為模板擴(kuò)增得到的MC4R基因純化后進(jìn)行測序，新發(fā)現(xiàn)502 bp處A/G單堿基顛換（圖2）?；蛐虯位于BseJⅠ識別序列內(nèi)。

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在750 bp附近得到1條特異性條帶（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致。采用限制性內(nèi)切酶BseJⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，出現(xiàn)3種基因型，分別命名為GG、AG、AA基因型。GG基因型得到758 bp 1個(gè)片段（圖4，泳道9）;AG基因型得到758、513、245 bp 3個(gè)片段（圖4，泳道4、5、14），AA基因型得到513、245 bp 2個(gè)片段（圖4，泳道1、2、3、6、7、8、10、11、12、13、15、16）。

2.4 基因和基因型頻率在受試羊群中的分布

在163只受試波爾山羊中，共檢測出3種基因型，AA型居多，占77.91%，AG型次之，占20.25%，GG型最少，占 1.84%（表1）;A基因頻率占88.1%，為優(yōu)勢基因。

2.5 A502G位點(diǎn)的效應(yīng)分析

由表2可知，在受檢的波爾山羊群體中，AA基因型個(gè)體初生體質(zhì)量、1周齡體質(zhì)量顯著高于AG基因型，1周齡體質(zhì)量極顯著高于GG基因型，2周齡、2月齡、3月齡體質(zhì)量顯著高于GG型，其他月齡體質(zhì)量差異不顯著。

2.6 MC4R基因4個(gè)位點(diǎn)的聚合效應(yīng)分析

在受試波爾山羊中，A502G、C693T、A946C、C986T位點(diǎn)共存在8種不同的基因型組合，分別為AACCAACC型、AACCAACT型、AACTACCC型、AACTACTT型、AGCCAACC型、AGCCAACT型、AGCTACCC型和GGCCAACC型，其中聚合基因型AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型樣本少于3個(gè)，不參與分析。由表3可知，AACCAACC型個(gè)體初生體質(zhì)量顯著高于AGCCAACC型，AACCAACT型個(gè)體周歲體質(zhì)量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指標(biāo)間無顯著差異。

3 討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。人MC4R基因的突變可導(dǎo)致早期遺傳性肥胖[10-11]，豬、兔、雞、牛、犬等均已發(fā)現(xiàn)MC4R基因存在于與體質(zhì)量性狀相關(guān)的SNPs。如Kim等對數(shù)個(gè)豬品系的研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因第7跨膜功能域的1個(gè)G/A突變可引起豬膘厚、體質(zhì)量和采食量的顯著變化[12-14]。El-Sabrout等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因突變對兔體質(zhì)量有顯著影響[15-17]。仇雪梅等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)上的4個(gè)突變對雞的體質(zhì)量、屠體性狀有顯著影響[18]。Cai等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因C1069G突變顯著影響18月齡牦牛的體質(zhì)量和日增質(zhì)量[19]。Song等研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因3′調(diào)控區(qū)的4個(gè)突變與湖羊45 d斷奶體質(zhì)量顯著相關(guān)[20]。張軼博等研究發(fā)現(xiàn)，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體質(zhì)量顯著相關(guān)[21]。目前，關(guān)于山羊MC4R基因多態(tài)性及與其生長性狀關(guān)系的研究仍然較少，是否存在新的影響山羊生長性狀的MC4R位點(diǎn)及基因型組合有待進(jìn)一步研究。

本研究設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增波爾山羊MC4R基因序列，通過DNA池為模板PCR擴(kuò)增MC4R基因，結(jié)合測序法篩選其在波爾山羊群體中的SNPs位點(diǎn)，在編碼區(qū)中新檢測到A502G單堿基顛換，且在波爾山羊群體中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在3種基因型，將其與波爾山羊的體質(zhì)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AA基因型個(gè)體初生體質(zhì)量、1周齡體質(zhì)量顯著高于AG基因型（P<0.05），1周齡體質(zhì)量極顯著高于GG基因型（P<0.01），2周齡、2月齡、3月齡體質(zhì)量顯著高于GG型（P<0.05），說明A基因?qū)w質(zhì)量的增加更有利。該單堿基顛換導(dǎo)致MC4R氨基酸序列1 168 V（異亮氨酸→纈氨酸）變化，推測可能影響MC4R蛋白功能，從而引起體質(zhì)量表型變化。

研究表明，生長性狀是由多基因控制的且存在互作作用，單個(gè)遺傳標(biāo)記效應(yīng)相對較小，不同位點(diǎn)的聚合效應(yīng)分析將更有利于提高標(biāo)記輔助選擇改良畜禽生產(chǎn)性能的效果。Wang等的研究發(fā)現(xiàn)，湖羊MC4R基因H1H3基因型組合的生產(chǎn)性能均高于其他基因型組合[22]。趙憲林等研究發(fā)現(xiàn)，藏羊MC4R基因H13H7雙倍型的各個(gè)生長性狀表現(xiàn)最優(yōu)[23]。黃毅研究發(fā)現(xiàn)，鵝MC4R基因H3H3基因型組合的活質(zhì)量、屠體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量、胸肌質(zhì)量與H4H4基因型組合的肝質(zhì)量、肝體比、肝屠比和腹脂率顯著高于其他基因型組合[24]。唐現(xiàn)文研究發(fā)現(xiàn)，黑羽番鴨MC4R基因的C645T和G672A等2處基因型組合對公鴨活體質(zhì)量和屠宰性能均有顯著影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，山羊MC4R基因C693T、A946C、C986T、A502G等4個(gè)位點(diǎn)在受檢波爾山羊群體中存在8種基因型組合。單因素方差分析表明，AACCAACC型個(gè)體初生質(zhì)量顯著高于AGCCAACC型，AACCAACT型個(gè)體周歲體質(zhì)量顯著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指標(biāo)間無顯著差異。由于AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型樣本少于3個(gè)，無法進(jìn)行差異顯著性分析，因此還須擴(kuò)大樣本數(shù)，進(jìn)一步研究這些基因型組合與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)性，以全面了解不同基因型組合的效應(yīng)，為更好地利用基因型組合進(jìn)行生長性狀的輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

MC4R基因是畜禽經(jīng)濟(jì)性狀的重要候選基因，在哺乳動物的體質(zhì)量和體長調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)MC4R基因的A502G位點(diǎn)A基因?qū)ι窖蛟缙隗w質(zhì)量增加更有利，基因型組合AACCAACT對山羊周歲體質(zhì)量增加更有利，可以作為山羊生長性狀選擇的候選分子標(biāo)記。

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