陳丹丹 朱肖鴻

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

肝纖維化（HF）是指由于各種致病因子致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，肝內(nèi)細胞外基質(zhì)廣泛過度沉積的一種病理過程，是所有慢性肝病的病理基礎(chǔ)[1]。肝纖維化是慢性肝病的重要病理特征，是疾病發(fā)展成為肝硬化的一個必經(jīng)階段[2]。T淋巴細胞是介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的主要免疫細胞，細胞免疫對于保持機體的正常免疫監(jiān)視、防御和調(diào)節(jié)功能，避免機體發(fā)生合并感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病發(fā)生有重要作用，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞是具有不同功能的T淋巴細胞亞型，前者主要起輔助T細胞作用，后者具有殺傷T細胞效應(yīng)。肝硬化患者多存在免疫功能紊亂或免疫功能低下，當(dāng)T淋巴細胞亞群比例失調(diào)時，肝硬化患者容易發(fā)生嚴(yán)重的合并感染或向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變[3]。本實驗主要研究熊膽粉治療前后肝纖維化大鼠CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的變化。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗材料：10g雄性SPF級F344大鼠27只，購自南方模式動物中心[生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2015-0001，使用許可證：SYXK（蘇）2015-0001]。PBS：生產(chǎn)廠家Solarbio，中國北京。CD4-FITC：生產(chǎn)廠家ebioscience，11-0040-82。CD8-PE：生產(chǎn)廠家ebioscience，12-0084-80。Ficoll：生產(chǎn)廠家GE，17-5442-02。

1.2 實驗儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱：生產(chǎn)廠家Thermo Scientific，Waltham，USA。倒置顯微鏡：生產(chǎn)廠家Olympus，Tokyo，Japan。生物安全柜：生產(chǎn)廠家Thermo Scientific，Waltham，USA。常溫/冷凍離心機：生產(chǎn)廠家Eppendorf，Hamburg，German。移液器：生產(chǎn)廠家Eppendorf，Hamburg，German。流式細胞儀：生產(chǎn)廠家 Novocyte，451140510506。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及處理方法：對照組9只：注射用生理鹽水1ml/kg連續(xù)每周3d，腹腔內(nèi)注射共4周，同時用生理鹽水2ml/d灌胃，共4周；肝纖維化模型組（模型組）9只：10g/L二甲基亞硝胺（DMN）（生理鹽水稀釋）1ml/kg連續(xù)每周3d，腹腔內(nèi)注射共4周，同時用生理鹽水2ml/d灌胃共4周；熊膽粉治療組（治療組）9只：10g/L DMN腹腔內(nèi)注射的同時用熊膽粉400mg/kg?d灌胃共4周。在第2周末和第4周末，進行細胞檢測。

2.2 流式細胞檢測：流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+的比值。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析：組間分析采用Student’s t test（兩組）或單因素方差分析（one-way ANOVA，兩組以上）方法。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）表示。P＜0.05視為具有顯著差異。

3 實驗結(jié)果

與對照組相比，肝纖維化模型組肝組織來源的細胞群中CD4+陽性細胞的比例顯著降低（P＜0.05），CD8+陽性細胞的比例顯著升高（P＜0.01），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.01）；熊膽粉治療組肝組織來源的細胞群中CD4+陽性細胞的比例降低（P＜0.05），但顯著高于肝纖維化模型組（P＜0.01），CD8+陽性細胞的比例顯著升高（P＜0.01），但顯著低于肝纖維化模型組（P＜0.01），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.01），但顯著高于肝纖維化模型組（P＜0.01）。上述結(jié)果表明肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞比例及CD4+/CD8+比值較正常組顯著降低，CD8+陽性細胞比例顯著升高，而熊膽粉對肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞降低、CD8+陽性細胞比例的升高及CD4+/CD8+比值降低有顯著的負調(diào)控作用。見表1和圖1。

表1 各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較（±s）

表1 各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

CD4+/CD8+2.97±0.28 0.48±0.06**0.78±0.06**##組別 只數(shù)對照組 9模型組 9治療組 9 CD4+（%）50.54±4.13 31.91±0.61*38.32±1.13*##CD8+（%）17.03±0.23 66.89±6.61**49.38±4.13**##

圖1 流式檢測CD4+和CD8+陽性細胞的比例

4 討論

肝硬化是多種慢性肝臟疾病的終末階段，以彌漫性肝纖維化伴異常結(jié)節(jié)形成為其形態(tài)學(xué)特征，嚴(yán)重影響人類健康。目前尚無有效的抗肝纖維的化學(xué)或生物藥物進入臨床應(yīng)用[4]。近年來，多有報道顯示中醫(yī)藥在抑制肝臟炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能及纖維組織增生，促進肝纖維化的逆轉(zhuǎn)等方面效果明顯[5-6]。浙江已故名中醫(yī)潘澄濂擅長治療肝病，將肝硬化分為積聚型和鼓脹型辨治，并總結(jié)病毒性肝炎后肝硬化的八種治法[7]，頗有療效。

熊膽為熊科動物黑熊或棕熊的干燥膽囊，是臨床常用的傳統(tǒng)名貴藥材。其味苦，性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血之功[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，熊膽粉水解液中，含有去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸[11]。權(quán)明吉等[12]用DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化，予400mg/kg熊膽粉灌胃4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熊膽粉可以抑制DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化。研究現(xiàn)已證實[12]，熊膽可通過抑制肝星狀細胞激活與轉(zhuǎn)化而減輕DNM所致肝損害，抑制肝纖維化形成，進而減緩肝硬化進程。

T淋巴細胞是一類重要的免疫細胞，T細胞的比值和絕對數(shù)發(fā)生改變被認為是免疫功能紊亂。成熟的T細胞根據(jù)CD4+、CD8+分子表達的不同，可以分為CD4+或CD8+T細胞。CD4+T細胞因為具有輔助體液免疫和細胞免疫的功能，所以被稱為輔助性T細胞。有研究表明，肝硬化患者存在免疫功能下降。本研究發(fā)現(xiàn)，通過DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化，從免疫方向研究得出，肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞比例及CD4+/CD8+比值較正常組顯著降低，CD8+陽性細胞比例顯著升高。結(jié)果顯示，熊膽粉對肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞降低、CD8+陽性細胞比例升高及CD4+/CD8+比值降低有顯著的負調(diào)控作用。