陳 瑜

浙江省杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 311400

本研究結(jié)合老年男性骨質(zhì)疏松癥腎虛證臨床觀察和研究基礎(chǔ)，以生物信息學(xué)、基因多態(tài)性檢測(cè)等現(xiàn)代技術(shù)為手段，探討VDR、AR、CYP19基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的分布差異與骨密度之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料：選擇我院漢族男性就診者和體檢者178例（年齡≤60歲），其中骨質(zhì)疏松癥腎虛證患者98例，體檢腎虛證者80例。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)（第三稿）》。中醫(yī)證候診斷參照全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會(huì)1986年制定的標(biāo)準(zhǔn)和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》。排除繼發(fā)性骨質(zhì)疏松、其他嚴(yán)重疾病干擾骨代謝者、3月內(nèi)使用過其他影響骨代謝藥物的患者。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 骨密度測(cè)定：采用美國(guó)好樂杰QDR-4500雙能X線骨密度儀檢測(cè)患者正位腰椎(L2～L4)，左側(cè)髖部，包括股骨頸(Neck)、Wards三角、大轉(zhuǎn)子(Torch)、股骨粗隆(Trock)的骨密度BMD(g/cm2)。

1.2.2 SNPs測(cè)定：采集所有受試者靜脈血2.5ml，于EDTA抗凝管儲(chǔ)存。提取外周血白細(xì)胞DNA于-20℃儲(chǔ)存。①VDR基因等位基因測(cè)定：利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，選用Fok I上游引物：5'-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3'，下游引物：5'-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3'。擴(kuò)增反應(yīng)體系20μl，包含100ng基因組DNA，dNTP混合液200μmol/L，5×PCR反應(yīng)緩沖液4μl，Taq聚合酶1U，2μlPCR引物。預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，20s，退火60℃，30s，延伸72℃，20s，循環(huán)35次。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸7min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收保證DNA濃度及純度。PCR產(chǎn)物用FokI限制性核酸內(nèi)切酶(由NEB提供)酶切后，將樣品置于1%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。②CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性測(cè)定：利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，選用CYP19上游引物：5'-CGGTATGCATGAGAAAGGCAT-3'，下游引物：5'-GGTCACTCCTGCCTGGGTG-3'。PCR體系與①中所述相同。PCR產(chǎn)物送樣測(cè)序分析。③AR基因(CAG)n多態(tài)性測(cè)定：利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，選用AR上游引物：5'-CCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3'，下游引物：5'-CCTCATCCAGGACCAGGTAGCCT-3'。PCR反應(yīng)體系與①中所述相同。PCR產(chǎn)物送樣測(cè)序分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，χ2檢驗(yàn)用于VDR，CYP19，AR基因SNPs基因型以及等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；兩組數(shù)據(jù)組間基因型和等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)；均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR基因等位基因頻率分布：根據(jù)VDR基因FokI酶切結(jié)果（圖1），我們對(duì)骨質(zhì)疏松腎虛證老年男性患者與體檢腎虛證組老年男性進(jìn)行基因型及基因頻率分析。如圖1所示，與體檢腎虛證者組相比較，骨質(zhì)疏松腎虛證老年男性患者基因型分布具有顯著性差異（P＜0.05），骨質(zhì)疏松腎虛證患者中FF基因型較多，F(xiàn)f型顯著減少，f等位基因頻率顯著減少（c2=12.731P=0.002），提示著FF基因型可能具有較高的骨質(zhì)疏松發(fā)生率（見表1）。

圖1 部分樣品FokI酶切結(jié)果

表1 VDR基因FokI基因型及等位基因頻率

2.2 AR基因（CAG）n基因頻率及與骨密度的關(guān)系：AR（CAG）n重復(fù)序列測(cè)序結(jié)果表明，全部樣本AR（CAG）n重復(fù)次數(shù)介于13～33，平均21。骨質(zhì)疏松腎虛癥患者人群中 AR（CAG）n重復(fù)數(shù)最短為 13，最長(zhǎng)為 34，平均值為22.67± 3.55，重 復(fù) 數(shù) 最 多 為 20（10.20%）和 23（26.53%），見表2；體檢腎虛證組人群中AR（CAG）n重復(fù)數(shù)平均值為21.73±2.96，與骨質(zhì)疏松腎虛癥患者人群比較差異不顯著（P＞0.05），重復(fù)數(shù)最多為20（32.50%）和24（10%）。結(jié)果表明AR基因（CAG）n各短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性與骨密度無相關(guān)性。

2.3 CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性分布：與體檢腎虛證組相比，骨質(zhì)疏松腎虛證組患者CYP19基因（TTTA）n純合基因型TCT/TCT基因頻率明顯增高，雜合與純合-/-型明顯降低（P＜0.05）；骨質(zhì)疏松腎虛證組患者的TCT等位基因頻率明顯增高（P＜0.05），見表2。

表2 CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性分布

2.4 CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性與骨密度的關(guān)系：CYP19基因?yàn)門CT/-、-/-型的老年男性，其腰椎L2～L3、股骨頸(Neck)、Wards、股骨粗隆的骨密度要明顯低于TCT/TCT型老年男性（P＜0.05，P＜0.01）。而TCT/-、-/-型的老年男性之間比較，各部位的骨密度無顯著變化（P＞0.05）。多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，CYP19不同基因型的分布與腰椎L2～L3、股骨頸、Wards及股骨粗隆的骨密度存在著顯著相關(guān)（P＜0.05），見表3、表4。上述結(jié)果說明CYP19基因的TCT/-型、-/-型與低骨密度密切相關(guān)。

表3 CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性與骨密度的關(guān)系

表4 CYP19基因(TTTA)n多態(tài)性與骨密度的相關(guān)性分析

3 討論

中醫(yī)學(xué)“骨痿”與“骨痹”的闡述，可對(duì)應(yīng)骨質(zhì)疏松的癥狀?！端貑枴く浾摗氛撌?，“腎氣熱”是致“骨痿”的主要誘因。腎藏精生髓生骨，“腎實(shí)則骨有生氣”，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎臟與骨生理關(guān)系密切。特別是老年人腎臟虛虧，腎精不足，精不生髓，髓不足則筋骨枯萎，是為“骨痿”，可見骨質(zhì)疏松癥與腎虛證具關(guān)聯(lián)性[1]。維生素D受體的功能及蛋白表達(dá)是受VDR基因多態(tài)性的調(diào)控的，通過VDR的調(diào)節(jié)維生素D能夠在體內(nèi)進(jìn)一步的調(diào)節(jié)鈣磷代謝平衡，促進(jìn)成果細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，并進(jìn)一步的促進(jìn)骨形成和骨吸收。VDR基因多態(tài)性影響骨代謝及骨質(zhì)疏松癥，特別是與老年女性骨質(zhì)疏松癥關(guān)系緊密[2]。研究表明腰椎骨、股骨頸和全身的平均骨密度與VDR多態(tài)性存在著一定的關(guān)聯(lián)[3]。本研究中VDR基因多態(tài)性影響老年男性骨質(zhì)疏松癥腎虛證患者骨密度，與其他報(bào)道一致。

研究表明TTTA等位基因可能會(huì)造成CYP19功能編譯從而影響雌激素合成過程中的芳香族酶活性進(jìn)而影響了激素調(diào)節(jié)途徑從而造成骨質(zhì)疏松發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道了CYP19基因3號(hào)外顯子的沉默多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生，同時(shí)CYP19基因（TTTA）n雜合型和純合顯性型會(huì)影響絕經(jīng)后婦女患骨質(zhì)疏松的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究對(duì)雌激素合成調(diào)控基因CYP19基因多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CYP19基因（TTTA）n串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松存在著顯著相關(guān)性。

雖然研究表明AR可以激活破骨細(xì)胞分化因子RANKL來間接發(fā)揮作用促進(jìn)骨代謝[4]。但本試驗(yàn)開展的雄激素受體AR基因多態(tài)性研究分析顯示，AR基因（CAG）n短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性與骨密度無顯著相關(guān)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VDR、CYP19基因多態(tài)性與老年男性骨質(zhì)疏松腎虛證存在相關(guān)性，這為臨床診治骨質(zhì)疏松癥腎虛證提供了新的線索。