朱新術(shù)，趙文慧，張苗，楊學(xué)藝，陳曦，胡秀秀

（1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223005；2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，江蘇淮安 223005）

熱纖梭菌是一類(lèi)能夠特異降解木質(zhì)纖維素的高溫厭氧菌[1]，目前大多數(shù)學(xué)者集中于利用熱纖梭菌產(chǎn)乙醇研究[2]，直接利用該菌發(fā)酵濾紙進(jìn)行產(chǎn)葡萄糖和纖維寡糖的研究并不多見(jiàn)[3]。葡萄糖在發(fā)酵工業(yè)、畜牧業(yè)和食品工業(yè)中有重要應(yīng)用。在動(dòng)物保健領(lǐng)域，纖維寡糖和益生菌復(fù)合制劑，主要用于改善熱應(yīng)激肉雞腸道功能[4]和氮排放研究[5]，并能改善斷奶仔豬腹瀉情況和提高飼料利用率[6]等。

實(shí)驗(yàn)室前期已用熱纖梭菌常規(guī)培養(yǎng)基GS-2 進(jìn)行了發(fā)酵濾紙產(chǎn)葡萄糖和可溶性總糖研究，但糖得率和濾紙轉(zhuǎn)化率并不高。本文首先分別利用均勻設(shè)計(jì)，得到GS-2 培養(yǎng)基中對(duì)產(chǎn)糖影響較大的7 個(gè)因素及其取值范圍，接著通過(guò)逐步回歸建立培養(yǎng)基成分和優(yōu)化目標(biāo)間的二次多項(xiàng)式回歸模型，并用Matlab 軟件包優(yōu)化工具箱中的fmincon函數(shù)在培養(yǎng)基成分的取值范圍內(nèi)求取回歸模型的最優(yōu)解和最優(yōu)值。最后實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方程程的有效性，并用HPLC 分析纖維寡糖的成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱纖梭菌ATCC 35609 野生株，由美國(guó)Oklahoma 大學(xué)周集中教授饋贈(zèng)；酵母粉，分析純，英國(guó)OXOID 公司；纖維寡糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

0.22μm 濾膜，Millipore；普通紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SBA-40E 雙通道生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；高速離心機(jī)（Neofuge 23R），上海力申科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀Waters1525。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

種子培養(yǎng)基為GS-2 培養(yǎng)基（g/L），KH2PO41.5；K2HPO4·3H2O 3.8；尿素2.1；MgCl2·6H2O 1.0；CaCl2·2H2O 0.15；FeSO4·7H2O 0.00125；半胱氨酸鹽酸鹽1.0；纖維二糖5.0；morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0；酵母粉6.0；Na3C6HO7·2H2O 3；氧化還原指示劑刃天青0.002；初始pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基由濾紙（剪成0.5-4cm）、酵母粉、氯化鎂、半胱氨酸、尿素、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣構(gòu)成，其中濾紙濃度為20g/L，刃天青0.002g/L 和FeSO4·7H2O 0.00125g/L，其余成分具體配比見(jiàn)表1，初始pH 8.0±0.02。

1.2 培養(yǎng)條件

熱纖梭菌種子60℃培養(yǎng)1d。然后以4%（v/v）接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，60℃培養(yǎng)8d。均用100 mL 厭氧瓶，裝液量為40 mL 進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 葡萄糖測(cè)定方法

發(fā)酵液10,000rpm,4℃離心5min，取上清液，然后用0.22μm 濾膜過(guò)濾，濾液稀釋到一定倍數(shù)，使葡萄糖濃度在1g/L 以下，并用生物傳感器測(cè)定葡萄糖的濃度。

1.3.2 可溶性總糖測(cè)定方法

采用蒽酮-硫酸法[7]測(cè)定濾液中可溶性總糖的濃度。

1.3.3 纖維寡糖含量測(cè)定

用HPLC 法測(cè)定濾液中纖維寡糖的濃度[8]。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選取發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉、氯化鎂、半胱氨酸鹽酸鹽、K2HPO4、KH2PO4、尿素和氯化鈣進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，其余成分保持為初始培養(yǎng)基中的濃度狀態(tài)。參考《均勻設(shè)計(jì)與均勻設(shè)計(jì)表》[9]，選用U10*(108)均勻設(shè)計(jì)表安排7 因素10 水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（表1），并把初始培養(yǎng)基作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有配方均進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤為準(zhǔn)。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基成分和葡萄糖與可溶性糖之間的二次多項(xiàng)式回歸模型建立通過(guò)MATLAB 軟件包(R2018b,Mathworks,USA)逐步回歸函數(shù)stepwise 實(shí)施；葡萄糖和可溶性總糖的二次多項(xiàng)式回歸模型在自變量的取值范圍內(nèi)，利用MATLAB 優(yōu)化工具箱中的fmincon 函數(shù)求取培養(yǎng)基最佳組合和相應(yīng)的優(yōu)化目標(biāo)最佳預(yù)測(cè)值。

表1 均勻設(shè)計(jì)U10(*108)實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵結(jié)果

表2 葡萄糖與可溶性總糖回歸模型效果

利用表2 中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后，測(cè)得每種培養(yǎng)基組合相應(yīng)的葡萄糖與可溶性總糖的濃度。易知葡萄糖濃度為1 號(hào)實(shí)驗(yàn)和9 號(hào)實(shí)驗(yàn)獲得，分別為7.75 g/L 和12.33 g/L，比優(yōu)化前的對(duì)照初始培養(yǎng)基的6.63 g/L 和9.78 g/L，分別提高了16.89%和26.07%倍。

2.2 基于逐步回歸函數(shù)stepwise 的回歸建模

表3 葡萄糖與可溶性總糖二次多項(xiàng)式回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

利用MATLAB R2018b 軟件包逐步回歸函數(shù)stepwise 建立培養(yǎng)基成分與發(fā)酵液中葡萄糖濃度與可溶性總糖濃度的二次多項(xiàng)式回歸模型（表3）

兩個(gè)方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明：本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型是極顯著性的(P＜0.01)，決定系數(shù)R2均為0.999，表明此模型擬合優(yōu)度好，分別僅有約1%的變異不能由模型解釋。此外，除了小部分模型項(xiàng)之外（如X22），絕大部分模型項(xiàng)具有顯著性(P＜0.05)，并且均勻設(shè)計(jì)葡萄糖與可溶性總糖的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差均不超過(guò)2%（表2），由此充分說(shuō)明采用二次多項(xiàng)式回歸模型對(duì)發(fā)酵液葡萄糖和可溶性總糖濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)的可行性和有效性。

2.2.4 模型求解與驗(yàn)證

利用MATLAB 優(yōu)化工具箱中的fmincon 函數(shù)求取葡萄糖和可溶性總糖的二次多項(xiàng)式回歸方程在自變量的取值范圍內(nèi)的培養(yǎng)基最佳組合和相應(yīng)的優(yōu)化目標(biāo)最佳預(yù)測(cè)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)葡萄糖的最佳培養(yǎng)基為（g/L）：酵母粉（X1），5.379；MgCl2·6H2O（X2），0.424；半胱氨酸鹽酸鹽（X3），0.996；K2HPO4·3H2O（X4），7.99；KH2PO4（X5），4.991；尿素（X6），1.171 和CaCl2·2H2O（X7），0.072，相應(yīng)優(yōu)化目標(biāo)最佳預(yù)測(cè)值為8.559 g/L。產(chǎn)可溶性總糖的最佳培養(yǎng)基為（g/L）：酵母粉（X1），3.5；MgCl2·6H2O（X2），2.0；半胱氨酸鹽 酸 鹽（X3），0.788；K2HPO4·3H2O（X4），8.0；KH2PO4（X5），1.4；尿素（X6），4.0 和CaCl2·2H2O（X7），0.05，相應(yīng)的優(yōu)化目標(biāo)最佳預(yù)測(cè)值為15.899 g/L。

在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，得出葡萄糖和可溶性總糖的濃度分別為9.00±1.05 g/L 和15.452±1.81 g/L，因此實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的誤差分別為5.15%和-2.89%，分別比均勻設(shè)計(jì)最高結(jié)果的7.75±0.87（即表2 中第1 號(hào)實(shí)驗(yàn)）和12.332±1.39（即表2 中第9 號(hào)實(shí)驗(yàn)）分別提高了16.13%和25.32%，比初始對(duì)照培養(yǎng)基的6.63±1.09 和9.78±1.02 分別提高了35.75%和58.0%?？梢?jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。且最優(yōu)化條件下，熱纖梭菌發(fā)酵濾紙（20g/L），葡萄糖和可溶性總糖的得率分別為45%和77.26%。

2.3.5 可溶性總糖中纖維寡糖的HPLC 分析

在可溶性總糖最佳培養(yǎng)基驗(yàn)證時(shí)，可溶性總糖濃度為15.452 g/L，測(cè)得葡萄糖含量為6.46 g/L，且用HPLC 測(cè)得纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的濃度分別為3.172g/L、2.816g/L、1.593g/L 和1.162g/L，由于纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的摩爾分子量分別為342.3、504.4、666.6 和828.7，因此熱纖梭菌發(fā)酵濾紙產(chǎn)生的寡糖相應(yīng)的摩爾比率大致為9:5:2:1，也就是纖維寡糖產(chǎn)物，大部分為纖維二糖和纖維三糖。

3 結(jié)論

本文通過(guò)均勻設(shè)計(jì)和基于逐步回歸的二次多項(xiàng)式建模研究，優(yōu)化了熱纖梭菌ATCC35609 發(fā)酵濾紙產(chǎn)葡萄糖和可溶性總糖的最佳培養(yǎng)基分別為（g/L）：酵母粉，5.379；MgCl2·6H2O，0.424；半胱氨酸鹽酸 鹽，0.996；K2HPO4·3H2O，7.99；KH2PO4，4.991；尿素，1.171；CaCl2·2H2O，0.072 和酵母粉，3.5；MgCl2·6H2O，2.0；半胱氨酸鹽酸鹽，0.788；K2HPO4·3H2O，8.0；KH2PO4，1.4；尿素，4.0；CaCl2·2H2O，0.05。結(jié)果不僅使濾紙的產(chǎn)葡萄糖和可溶性總糖的產(chǎn)率分別高達(dá)9.00 g/L 和15.452 g/L，且得率分別為45%和77.26%。還通過(guò)HPLC分析表明熱纖梭菌發(fā)酵濾紙產(chǎn)生的寡糖相應(yīng)的摩爾比率大致為 9:5:2:1，且大部分為纖維二糖和纖維三糖，從而為利用熱纖梭菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)纖維寡糖以開(kāi)發(fā)相應(yīng)的飼料添加劑奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。