魏科祥，張 璇，曹 華

(1.西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002； 2.咸寧市中心醫(yī)院，湖北 咸寧 437100)

隨著我國經(jīng)濟(jì)社會的快速發(fā)展和人口結(jié)構(gòu)的老齡化，骨質(zhì)疏松的患病率日益升高，流行病學(xué)研究表明，在我國50歲以上人群中骨質(zhì)疏松的患病率為 ：女性20.7%，男性14.4%[1]。骨質(zhì)疏松是一種全身骨代謝性疾病，其主要特征是骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)改變，伴隨骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加及骨折危險性增加等[2],其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是女性常見病，嚴(yán)重危害中老年婦女的健康，并影響其生活質(zhì)量[3]。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，骨質(zhì)疏松屬于“骨痿”“骨痹”范疇，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松根源于腎，病在骨，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)，骨枯髓減，發(fā)為骨痿[4]。本研究采用電針腎俞、足三里聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯來考察該治療方法對去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響，并通過其對骨組織和血清GH/IGF-1系統(tǒng)的影響初步探討其作用機(jī)制，以期為該聯(lián)合療法在臨床的更廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性Wistar大鼠30只，4～6月齡，體質(zhì)量(200±20)g，清潔級，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證號 ：SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2 試劑與儀器 華佗牌電針儀(型號 ：SDZ-II，廣東省普寧市普慈醫(yī)療器械有限公司)；雙能X射線骨密度儀(型號 ：InAlyzer，韓國)；酶標(biāo)分析儀(型號 ：DNM-9606，北京普朗醫(yī)療技術(shù)有限公司)；大鼠(GHR)Elisa試劑盒(SY-R305，上海雙贏生物科技有限公司)；大鼠(IGF-1)Elisa試劑盒(SBJ-R0761，南京森貝伽生物科技有限公司)；大鼠(IGF-1R)Elisa試劑盒(GOY-SJH205，上海谷研生物科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 滋腎強(qiáng)骨湯由熟地黃、人參、山萸肉、茯苓、山藥、黃芪、丹皮、杜仲、懷牛膝、桑寄生、菟絲子、續(xù)斷和甘草配伍組成。具有健脾益氣、補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功效。

1.2 分組及模型復(fù)制

大鼠在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境減少應(yīng)激。將實(shí)驗(yàn)大鼠按照體質(zhì)量區(qū)組化隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰位固定。剪開腹部皮膚、鈍性剝離肌肉層，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢，縫合肌肉層及毛皮層[5]。術(shù)后腹腔注射青霉素抗菌治療1周后，恢復(fù)14天。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎和切除雙側(cè)卵巢，其他手術(shù)操作過程與模型組和治療組相同。自雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)后第4天起，逐只大鼠檢查陰道涂片，連續(xù)5天，以不出現(xiàn)角化細(xì)胞作為卵巢摘除手術(shù)成功的標(biāo)志。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

治療組在大鼠恢復(fù)14天后開始接受電針腎俞、足三里聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯進(jìn)行治療。針刺穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6](李忠仁主編)。選用華佗牌0.35 mm×25 mm毫針，腎俞、足三里平刺4～5 mm，選用SDZ-II型電針治療儀，刺激頻率設(shè)置為50次/s，刺激強(qiáng)度調(diào)整至大鼠針刺穴位局部肌肉輕微抽動，并保持安靜，10 min/次。每次電針結(jié)束后灌胃給藥滋腎強(qiáng)骨湯(濃度0.4 g/mL，給藥劑量1.25 mL/100 g體重)，每天早晚各1次，連續(xù)治療12周。假手術(shù)組和模型組大鼠每天2次灌胃等體積的生理鹽水。

1.4 指標(biāo)檢測

治療12周后，采用雙能X射線骨密度儀測定各組大鼠右側(cè)下肢脛骨骨密度。尾靜脈采血1 mL，靜置15 min后，3 000 r/min，離心10 min，取上層清液-20℃冷凍保存待測。取大鼠脛骨骨組織樣本，超微粉碎研磨后制備骨組織勻漿液，采用Elisa法測定骨組織和血清中GHR、IGF-1、IGF-1R蛋白水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨密度的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠右側(cè)下肢脛骨骨密度均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組大鼠脛骨骨密度顯著升高(P<0.05)，表明電針腎俞、足三里聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯可以升高去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度。見表1。

表1 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨密度的影響

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中GHR、IGF-1和IGF-1R的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨組織中GHR、IGF-1、IGF-1R含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠骨組織中GHR、IGF-1、IGF-1R含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中GHR、IGF-1和IGF-1R的影響

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清中GHR、IGF-1和IGF-1R的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中IGF-1、IGF-1R顯著下降(P<0.05)，GHR雖有下降的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，治療組大鼠血清中IGF-1R水平顯著提高(P<0.05)，但GHR和IGF-1水平變化不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 電針聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯對骨質(zhì)疏松大鼠血清中GHR、IGF-1和IGF-1R的影響

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是婦女發(fā)生骨折的首要影響因素，絕經(jīng)后雌激素尤其是雌二醇水平的斷崖式下跌是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因[7-8]。目前臨床上西醫(yī)對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要以雌激素的替代治療[9]和抑制骨吸收的口服雙磷酸鹽藥物治療[10]為主，但激素替代治療常會伴隨一些不良反應(yīng)的發(fā)生，并存在乳腺以及子宮內(nèi)膜腫瘤的安全隱患[11]；而口服雙磷酸鹽藥物會有一些胃腸道反應(yīng)，如食管潰瘍、胃酸倒流、嘔吐等[12]限制了其臨床的應(yīng)用。

中醫(yī)學(xué)治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松療效獨(dú)特，常采用益腎填精、疏肝解郁、補(bǔ)益脾胃、活血化瘀等治療原則[13]。其中，腎俞、足三里是臨床用于骨質(zhì)疏松癥治療較多的針灸穴位，腎俞穴歸屬足太陽膀胱經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽、調(diào)節(jié)生殖功能，緩解腰痛等功效；足三里穴屬足陽明胃經(jīng)，具有生發(fā)胃氣、燥化脾濕的功效，主治胃腸病證，下肢痿痹[6]。滋腎強(qiáng)骨湯為院內(nèi)經(jīng)方，臨床治療骨質(zhì)疏松癥多年，療效顯著，方中熟地黃為君藥，滋補(bǔ)腎陰、填精益髓；山藥為臣藥，養(yǎng)脾陰、護(hù)腎精；山萸肉固澀收斂，可防腎精外泄；牡丹皮泄火，可制山萸之溫澀；茯苓健脾健運(yùn)；杜仲、續(xù)斷、懷牛膝、菟絲子、桑寄生均有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨之力，黃芪與人參補(bǔ)氣益脾、鞏固氣血生化，合為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為佐使;諸藥配伍，共奏健脾益氣、補(bǔ)腎壯骨之效?；谝陨希狙芯繌腉H/IGF-1系統(tǒng)角度探討針刺電針腎俞、足三里聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

生長激素(Growth hormone,GH)是由腦垂體分泌的多肽類蛋白，具有促進(jìn)骨骼生長的作用。GH發(fā)揮作用依賴于其受體(Growth Hormone Receptor，GHR)，GHR主要存在于脂肪組織、腸道、腎臟、肝臟、肺、心臟、胰腺和骨等組織中[14]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GHR同時存在于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的表面，GH不但可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，而且還可激活破骨細(xì)胞，通過增加破骨細(xì)胞的聚集而促進(jìn)其分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨吸收[15]。

同時在體內(nèi)，GH也可以通過胰島素樣生長因子-1(Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1)發(fā)揮對骨組織的作用[16]。IGF-1主要由GH刺激肝臟分泌，其介導(dǎo)了GH在體內(nèi)的大部分生物功能，如促進(jìn)骨骼生長等[17]。IGF-1通過激活經(jīng)典的MARK信號通路來發(fā)揮對骨代謝的作用。成骨、破骨細(xì)胞同樣存在IGF-1的受體(IGF-1R)，IGF-1可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性并增加成骨細(xì)胞的數(shù)量[18]。RANKL是破骨細(xì)胞形成標(biāo)志物，文獻(xiàn)報道IGF-1可以通過降低RANKL的水平來降低破骨細(xì)胞的形成[19]。另外，研究表明，多種內(nèi)源性激素包括甲狀腺激素、性激素、甲狀旁腺素、糖皮質(zhì)激素等都影響體內(nèi)骨代謝的動態(tài)平衡。GH/IGF-1系統(tǒng)還可以通過對以上相關(guān)內(nèi)源性激素分泌的影響來間接調(diào)控骨代謝[20]。

總體而言，GH/IGF-1軸的功能對維持體內(nèi)骨量平衡的意義重大。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針腎俞、足三里聯(lián)合滋腎強(qiáng)骨湯可以明顯增加去卵巢大鼠的骨密度，并部分恢復(fù)骨組織和血清中GH/IGF-1系統(tǒng)的動態(tài)平衡。