郭玉紅,孫忠人,孫 琦,李竹馨

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

褥瘡又稱(chēng)“席瘡”“壓瘡”和“壓力性潰瘍”，多因長(zhǎng)期臥床以及護(hù)理不當(dāng)使患者局部組織受壓所致的皮膚破潰。作為一種臨床慢性難治性疾病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命健康，加重了患者及家屬的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。褥瘡的愈合是動(dòng)態(tài)的、互動(dòng)的過(guò)程，在褥瘡愈合過(guò)程中多種細(xì)胞和生長(zhǎng)因子參與其中，并起著重要的作用[1]。課題組研究發(fā)現(xiàn)電針傍刺能夠促進(jìn)褥瘡的愈合[2]，但電針傍刺促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)分布于細(xì)胞漿內(nèi)，是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，MAPK參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖和凋亡[3]，近年來(lái)MAPK在疾病、損傷等方面的研究成為了熱點(diǎn)。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，并在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在多種疾病中均發(fā)現(xiàn)了p38MAPK通路的激活，為多種疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供了新方向。本研究的目的是觀察電針傍刺是否通過(guò)p38MAPK通路影響創(chuàng)面修復(fù)，進(jìn)一步探討電針傍刺促進(jìn)瘡面修復(fù)的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康清潔級(jí)SD雌性大鼠，共150只，體質(zhì)量220～250 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黑)2013-001。飼養(yǎng)環(huán)境 ：在室溫20～25℃、濕度50%～60%的條件下，大鼠可以自由進(jìn)食、飲水，置于單籠飼養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物分組

將150只SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針傍刺組、模型抑制劑組和電針抑制劑組，共5組，其中每個(gè)組再根據(jù)1天、3天、5天、7天、9天干預(yù)時(shí)間分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.3 主要儀器及主要試劑

DM4000B顯微鏡(德國(guó)Leica);DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒);EG1160組織包埋機(jī);HI 1220烘片機(jī);RM2235型切片機(jī)(德國(guó)Leica);醫(yī)用微波爐(青島海爾);高速冷凍離心機(jī)(Hettich);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);制冰機(jī)(上海雪花);酶標(biāo)板(Corning);渦旋混勻器(蘇州捷美);酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特);轉(zhuǎn)膜儀、凝膠圖像分析軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)。SB203580(abcam,UK);石蠟、二甲苯(上海富宇);蘇木素染液(ZS-ZLI-9610);Anti-p38MAPK antibody(ab7952)(abcam，UK);SABC(兔IgG)-POD kit(SLB-SA0021);PBS緩沖液(SLB-P1010-2);BSA封閉液(SLB-SW3015);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天);β-Actin內(nèi)參抗體(上海生工)。

2 方法

2.1 模型制備

根據(jù)缺血再灌注的原理課題組自制了大鼠壓瘡造模裝置[5]，先用尼龍?jiān)鷰г阼F絲網(wǎng)上固定住大鼠，把大鼠膝關(guān)節(jié)骨隆突處的皮膚脫毛，常規(guī)碘伏消毒，再將碘伏消毒后的裝置垂直壓在消毒后的皮膚上，裝置的壓強(qiáng)為100 mmHg，大鼠局部皮膚每次持續(xù)受壓2 h后，放入籠中自由活動(dòng)半個(gè)小時(shí)，每日循環(huán)5次，連續(xù)造模3天。

2.2 干預(yù)方法

于造模后第2日評(píng)估褥瘡，將符合Ⅱ期褥瘡標(biāo)準(zhǔn)(2007年美國(guó)的國(guó)家壓瘡專(zhuān)家組建議方案)[6]的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。所有納入實(shí)驗(yàn)的大鼠均于第3日行干預(yù)治療。

電針傍刺 ：用碘伏常規(guī)消毒瘡面，將一根毫針(0.17 mm×7 mm)直刺在創(chuàng)面中心，另一根毫針斜刺在創(chuàng)面的邊緣外0.5 cm處，再將微電流電刺激儀(頻率 ：0.5 Hz，電流 ：500 μA)連接在針柄上，導(dǎo)線的正極置于創(chuàng)面邊緣，負(fù)極置于創(chuàng)面的中心，持續(xù)30 min，每日1次。

各組褥瘡大鼠的創(chuàng)面均用碘伏常規(guī)消毒，模型抑制劑組腹腔注射藥量為5 mg/kg[7]的p38MAPK特異性抑制劑SB203580，于30 min后予以碘伏常規(guī)消毒；電針抑制劑組先腹腔注射SB203580，30 min后再采用電針傍刺治療；模型對(duì)照組碘伏消毒前30 min腹腔注射與SB203580等量的生理鹽水；電針傍刺組先腹腔注射生理鹽水，30 min后再行電針傍刺治療；正常對(duì)照組每日腹腔注射等量的生理鹽水，不予以其他處置。

2.3 免疫組化檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化 ：將皮膚組織標(biāo)本放入石蠟包埋，取創(chuàng)面組織小于4 μm石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、水化，3% H2O2滅活，抗原修復(fù)，PBS沖洗， BSA封閉，滴加p38MAPK一抗，4℃過(guò)夜。37℃復(fù)溫20 min，PBS沖洗，滴加二抗，37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫組化結(jié)果分析 ：采用陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)法，取各組大鼠皮膚組織切片，在光鏡(40×10倍)視野下，p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色的細(xì)胞漿和細(xì)胞核，隨機(jī)在每張切片中選取5個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞，平均數(shù)作為 p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.4 蛋白免疫印跡法檢查

用凝膠圖像處理系統(tǒng)將X光膠片進(jìn)行灰度掃描，用ImageJ軟件測(cè)量各組目標(biāo)條帶的光密度值，再將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，方差齊的用ANOVA，多重比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊的用秩和檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 采用免疫組化方法檢測(cè)p38MAPK在創(chuàng)面組織中的蛋白表達(dá)

在高倍鏡下 ：1天，模型對(duì)照組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，電針傍刺組P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。模型對(duì)照組創(chuàng)面組織中p38 MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3天時(shí)逐漸增多，在5天、7天和9天時(shí)逐漸減少；而電針傍刺組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3天、5天、7天和9天時(shí)逐漸減少。腹腔注射抑制劑SB203580后，電針抑制劑組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與電針傍刺組比較減少，模型抑制劑組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與模型對(duì)照組比較減少。見(jiàn)表1、圖1和封三彩圖2。

表1 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

注:同一組內(nèi)相鄰時(shí)間比較,△P<0.05;相同時(shí)間與模型對(duì)照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。

注 ：同一組內(nèi)相鄰時(shí)間比較,△P<0.05;相同時(shí)間與模型對(duì)照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3.2 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK蛋白的表達(dá)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,1天時(shí)，電針傍刺組p38MAPK蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組亦明顯升高，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。模型對(duì)照組p38MAPK蛋白表達(dá)在3天時(shí)逐漸升高，5天、7天、9天時(shí)逐漸下降，電針傍刺組p38MAPK蛋白表達(dá)在3天、5天、7天、9天時(shí)逐漸下降。給予抑制劑SB203580后，模型抑制劑組與模型對(duì)照組比較各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)p38MAPK蛋白表達(dá)下降，電針抑制劑組與電針傍刺組比較p38MAPK蛋白表達(dá)亦下降。見(jiàn)表2、圖3～4。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38/β-Actin蛋白表達(dá)

注:同組相鄰時(shí)間點(diǎn)比較,△P<0.05;相同時(shí)間與模型對(duì)照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。

注 ：同組相鄰時(shí)間點(diǎn)比較,△P<0.05;相同時(shí)間與模型對(duì)照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38/β-Actin蛋白表達(dá)

注:Lane1代表正常對(duì)照組，Lane2代表模型對(duì)照組，Lane3代表電針傍刺組，Lane4代表模型抑制劑組，Lane5代表電針抑制劑組。圖4 各組p38/β-Actin蛋白表達(dá)

4 討論

褥瘡是長(zhǎng)期臥床的患者最容易出現(xiàn)的并發(fā)癥，是目前康復(fù)治療和護(hù)理工作的難題。目前，國(guó)內(nèi)外醫(yī)護(hù)工作者正不斷探求新的更有效的治療褥瘡的方法。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)多采用外治法輔以?xún)?nèi)治法來(lái)治療褥瘡，因針灸具有扶正祛邪、疏經(jīng)活絡(luò)、祛腐生肌的作用，許多中醫(yī)工作者采用針刺治療褥瘡取得了顯著效果[8-10]?，F(xiàn)代研究表明，電刺激能夠增強(qiáng)創(chuàng)面處上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)及血管的形成[11]。許多臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)電刺激能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)[12-13]。電針傍刺是利用針刺和電刺激的共同作用，在十二刺法中傍針刺的基礎(chǔ)上連接電針儀治療褥瘡的一種新的方法，體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的完美結(jié)合，將針刺與電刺激更好地應(yīng)用到褥瘡的治療中。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化檢測(cè)p38MAPK細(xì)胞因子，結(jié)果顯示 ：正常對(duì)照組大鼠皮膚組織中p38MAPK表達(dá)較弱，造模后褥瘡大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK表達(dá)增強(qiáng)。1天時(shí)，模型對(duì)照組和電針傍刺組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，表明p38MAPK被磷酸化而激活。電針傍刺組在3天、5天、7天和9天時(shí)p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，p38MAPK的峰值在1天；而模型對(duì)照組在3天時(shí)p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，在5天、7天和9天時(shí)p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，p38MAPK的峰值在3天，說(shuō)明電針傍刺促進(jìn)了p38MAPK蛋白表達(dá)。給予p38MAPK特異性抑制劑SB203580后，模型抑制劑組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與模型對(duì)照組比較減少，電針抑制劑組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與電針傍刺組比較亦減少，表明SB203580通過(guò)阻斷p38MAPK通路的活化抑制了電針傍刺的治療作用。

Western Blot結(jié)果顯示,1天時(shí)，模型對(duì)照組和電針傍刺組p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明褥瘡組織中p38MAPK被激活。3天時(shí)，模型對(duì)照組p38MAPK蛋白表達(dá)逐漸升高，5天、7天和9天時(shí)p38MAPK蛋白表達(dá)逐漸下降，模型對(duì)照組p38MAPK蛋白表達(dá)峰值在3天；而電針傍刺組p38MAPK蛋白表達(dá)峰值在1天，于3天、5天、7天和9天時(shí)逐漸下降，表明電針傍刺促進(jìn)了創(chuàng)面組織中p38MAPK蛋白表達(dá)。在給予SB203580后，電針抑制劑組和模型抑制劑組p38MAPK蛋白表達(dá)均下降，表明SB203580抑制了電針傍刺的治療作用。

由此可見(jiàn)，電針傍刺促進(jìn)了p38MAPK通路中p38MAPK蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了創(chuàng)面的修復(fù)，而SB203580延長(zhǎng)了創(chuàng)面愈合的時(shí)間，p38MAPK通路是電針傍刺促進(jìn)褥瘡創(chuàng)面修復(fù)的可能作用機(jī)制之一。