白婷婷 杜紅飛 許穎

老年性白內(nèi)障是一種以晶狀體混濁為特征的眼部疾病，可引起患者單側(cè)或雙側(cè)視力下降甚至失明，目前在致盲原因中居全球首位[1]。隨著人口的增

長和老齡化進(jìn)程的加速，老年性白內(nèi)障給家庭和整個(gè)社會都帶來了嚴(yán)重的壓力和負(fù)擔(dān)。目前還沒有靈敏度高、特異性強(qiáng)的早期診斷老年性白內(nèi)障的生物學(xué)指標(biāo)，因此，探討老年性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，找到早期診斷的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA) 是一組內(nèi)源性、長度大于200 nt、不含完整開放閱讀框、無或很少有蛋白編碼功能的RNA分子，可通過多種方式在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)節(jié)與之相關(guān)的蛋白編碼基因，參與疾病的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)開拓了LncRNA作為疾病生物學(xué)標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)研究的新領(lǐng)域。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA可通過不同機(jī)制參與許多眼部疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。本研究應(yīng)用LncRNA芯片篩選老年性白內(nèi)障患者與健康老年人差異表達(dá)的LncRNA，進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行小樣本復(fù)篩，初步探討LncRNA是否可以作為老年性白內(nèi)障患者早期篩查的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集收集來我院就診的老年性白內(nèi)障患者15例為病例組，性別、年齡相匹配的健康老年人15例為對照組。老年性白內(nèi)障的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：年齡≥50歲，矯正視力<0.7，晶狀體混濁，無其他導(dǎo)致視力障礙的眼病。兩組均采集清晨空腹的外周靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，3000 r·min-1離心5 min，收集血漿置于-80 ℃冰箱保存待用。排除溶血的樣本或血漿量少等不合格樣本。本研究獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)和患者的知情同意。

1.2 LncRNA芯片分析

1.2.1 血漿總RNA的提取和質(zhì)量控制隨機(jī)選取病例組和對照組各5例患者的血漿分別進(jìn)行混合，得到2組的混合血漿，采用Solarbio總 RNA 提取試劑盒(北京Solarbio公司)分別提取2組混合血漿的總RNA。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明操作：取200 μL血漿加500 μL裂解液室溫放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；然后加0.2 mL氯仿，離心、轉(zhuǎn)移水相、洗滌；最后用50 μL RNase free ddH2O溶解，使用Agilent ND-1000檢測RNA是否降解并測定RNA濃度。

1.2.2 標(biāo)記、雜交及數(shù)據(jù)采集和標(biāo)準(zhǔn)化使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit對上述溶解后的樣品進(jìn)行標(biāo)記，然后通過Agilent SureHyb 進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。芯片經(jīng)過洗滌后，使用Agilent DNA Microarray掃描儀掃描。利用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)采集芯片探針信號值以獲得原始表達(dá)值，使用Agilent GeneSpring GX v12.1軟件對信號值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.3 差異表達(dá)分析和功能分析使用Agilent GeneSpring GX v12.1軟件得到差異表達(dá)LncRNA譜。綜合原始表達(dá)值與標(biāo)準(zhǔn)化信號值間的倍數(shù)(Fold Change)選擇LncRNA進(jìn)行小樣本驗(yàn)證。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證選取病例組與對照組各10例患者的血漿對初篩的LncRNA進(jìn)行復(fù)篩。提取血漿總RNA后使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用20 μL體系，反應(yīng)條件為25 ℃ 5 min，46 ℃ 20 min，95 ℃ 1 min，最后4 ℃保存。采用2×SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (四川生工科技有限公司)，以 cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列見表1，以GAPDH作為內(nèi)參照。引物由四川生工科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。2-△△Ct法分析LncRNA的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

引物名稱引物序列T350772 上游引物5’-GGCTGCTCTTGAACTCCTGACC-3’T350772 下游引物5’-CGGTGGCTCACGCCTGTAATC-3’ENST00000532365 上游引物5’-GAAACGCACTGGAGAGCTGG-3’ENST00000532365 下游引物5’-AGCGTCCTGTGAGCGAAGAT-3’NR_110154 上游引物5’-GTCTAAGCTGGTGGCATGAAGAGG-3’NR_110154 下游引物5’-CAGGCAGCCTCACGATGTCTTG-3’

1.4 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析3個(gè)候選差異LncRNA在病例組與對照組間的表達(dá)量。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 芯片分析結(jié)果芯片分析結(jié)果顯示，病例組與對照組Fold Change 10以上，原始表達(dá)值在100以上的差異LncRNA共有91個(gè)，其中上調(diào)的有30個(gè)，下調(diào)的有61個(gè)。綜合上述兩個(gè)指標(biāo)，選擇LncRNA T350772、ENST00000532365和NR_110154進(jìn)行小樣本驗(yàn)證。

2.2 血漿中T350772、ENST00000532365和NR_110154表達(dá)的檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測病例組與對照組T350772、ENST00000532365和NR_110154的相對表達(dá)量結(jié)果見表2。由表2可知，LncRNA T350772、ENST00000532365和NR_110154在病例組與對照組中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

組別nT350772ENST00000532365NR_110154病例組101.719±0.7711.330±0.5240.8299±0.205對照組102.059±0.7671.777±0.8650.7754±0.281t值0.3090.4570.156P值0.7640.6570.878

3 討論

白內(nèi)障在我國是一種非常普遍的老年性疾病，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。它的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但任何先天性或后天性的導(dǎo)致晶狀體蛋白變性的因素都有可能導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。晶狀體內(nèi)的結(jié)構(gòu)性蛋白包括α、β和γ三個(gè)家族的晶狀體蛋白，這些蛋白的表達(dá)失調(diào)與結(jié)構(gòu)改變很可能是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的直接原因[3-4]。

視覺系統(tǒng)的維持需要相關(guān)基因的精確表達(dá)調(diào)控、正常的細(xì)胞增殖分化與免疫應(yīng)答等。異常的基因表達(dá)可能導(dǎo)致許多眼科疾病的發(fā)生，包括白內(nèi)障、青光眼、眼部腫瘤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA不僅可以直接結(jié)合靶基因來激活或抑制其表達(dá)，而且還參與組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、募集調(diào)控因子干擾轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)選擇性剪接及蛋白質(zhì)活性與定位等，在疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和防治上發(fā)揮重要的作用[5-6]。

目前，在其他眼部疾病中已經(jīng)報(bào)道了一些LncRNA，如MIAT、H19、MALAT1等[7-10]，其中所涉及的調(diào)控機(jī)制各不相同，一般是通過多種細(xì)胞因子及信號通路來發(fā)揮作用的。雖然關(guān)于LncRNA 的研究已經(jīng)取得了一些成果，但仍然處于起步階段，還未在某一具體眼科疾病中發(fā)現(xiàn)有決定意義的LncRNA，從而將其作為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物以及精準(zhǔn)治療的靶向分子。

本研究旨在尋找白內(nèi)障患者的血漿中可能存在的穩(wěn)定的特異性LncRNA，來作為早期診斷白內(nèi)障的生物學(xué)標(biāo)志物。首先我們收集白內(nèi)障患者與正常人的血漿，用LncRNA芯片篩選病例組與對照組差異表達(dá)的LncRNA，然后挑選出T350772、ENST00000532365和NR_110154進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行小樣本復(fù)篩來探究其在中國老年性白內(nèi)障發(fā)病過程中可能的作用。結(jié)果顯示，這3個(gè)LncRNA在病例組和對照組中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

樣本量較小是本研究的最大不足，結(jié)果可能存在偶然性。芯片分析在具備高通量、微陣列、大規(guī)模等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，重復(fù)性差也是不可避免的，因此可能會給篩選差異表達(dá)基因帶來誤差。另外病例組與對照組也可能存在其他未檢測出的疾病，從而影響血漿LncRNA的表達(dá)；標(biāo)本保存過程可能存在RNA的降解。所有這些因素都可能導(dǎo)致小樣本驗(yàn)證與芯片檢測的不符。

目前，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為老年性白內(nèi)障的發(fā)生與多種因素有關(guān)。因此，老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的鑒定非常具有挑戰(zhàn)性，同時(shí)這也是一件意義深遠(yuǎn)的事。早期篩查老年性白內(nèi)障高風(fēng)險(xiǎn)人群，可指導(dǎo)患者早期預(yù)防和治療，從而避免疾病帶來的不良影響。隨著人們對LncRNA研究的不斷深入及醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)的逐步發(fā)展，相信LncRNA在白內(nèi)障預(yù)防、診斷和治療中的作用一定會早日攻克。