應用Morris水迷宮實驗評估銀屑病對小鼠模型認知功能的影響

何磊 陳軍 陳麗莉 李雪飛 王皓 劉利君 秦樹存 李保強 段昕所

1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚病與性病科，河北 067000；2山東第一醫(yī)科大學動脈粥樣硬化研究所，山東泰安 271000

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，不僅累及皮膚，還可以累及其他系統(tǒng)［1］。認知功能包括信息處理、注意力、學習、記憶和語言能力等。認知功能障礙（cognitive impairment）指各種原因?qū)е碌牟煌潭鹊恼J知功能損害，影響患者的社會功能及生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。最新研究表明，銀屑病患者伴有早期或者輕微認知障礙，表現(xiàn)為長期記憶、執(zhí)行功能、注意功能、視空間功能下降，發(fā)生率高于普通人群，可達44%［2］。因此，我們擬采用Morris水迷宮實驗評價銀屑病小鼠模型認知功能的學習記憶能力，探索銀屑病對認知功能的影響。

一、材料

1.實驗動物：健康 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠 20 只，10月齡，體重30～45 g，產(chǎn)自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2016-0006，醫(yī)學實驗動物合格證書編號11400700294421。實驗期間小鼠飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學院動脈粥樣硬化研究所實驗動物中心標準動物房，12 h晝夜交替，室溫（24±2）℃，空氣濕度（50±10）%，除造模及必要的斷水斷食外，小鼠均可自由進水進食。實驗前動物先適應性飼養(yǎng)1周。本實驗遵循“減少、替代和優(yōu)化”為核心的3R原則。

2.主要試劑與儀器：5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限公司），凡士林乳膏（河北蘭煉飛天石化有限公司），小鼠水迷宮實時測試系統(tǒng)（美國CleverSys公司）。

二、實驗方法

1.銀屑病小鼠模型制備：取C57BL/6J 小鼠20 只，按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和銀屑病組各10只，兩組間小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義（t=0.111，P＞0.05）。通過腹腔注射4%水合氯醛（0.1 ml/kg）麻醉兩組小鼠后，將其背部約2 cm×2 cm毛發(fā)剃除，對照組背部外用凡士林，銀屑病組參考文獻［3］在背部給予5%咪喹莫特62.5 mg 每日1 次外涂。兩組均連續(xù)用藥1 周。水迷宮實驗結(jié)束后，頸椎脫臼法處死20只小鼠，取背部約1 cm×1 cm大小皮膚組織，4%多聚甲醛固定，按常規(guī)制成蠟塊，切片，HE染色，顯微鏡下觀察，評估模型建立情況。

2.Morris 水迷宮實驗［4］：造模成功后次日，用小鼠水迷宮實時監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測20只小鼠的活動狀況。Morris水迷宮選用小鼠通用型圓桶，水池直徑100 cm，高50 cm，水深25 cm，水溫控制在2 ～24 ℃，水中加白色染料，在水池壁的邊沿均勻分布4 個線性標記，由此將水池等分為四個象限，選第三象限正中放置高度23 cm、直徑6 cm 的平臺，沒入水下2 cm，迷宮外參照物保持固定。實驗分為定位航行階段和空間探索階段。

（1）定位航行實驗：將受試小鼠按順時針方向依次自第一、二、三、四象限入水點順序放入水中，記錄60 s內(nèi)尋找平臺的時間（逃逸潛伏期），如果小鼠在60 s內(nèi)找到平臺，則小鼠達到平臺的時間即逃逸潛伏期；如果在60 s 內(nèi)未找到平臺，逃逸潛伏期記錄為60 s，以小鼠逃逸潛伏期的長短來評價小鼠的空間學習能力。

（2）空間探索實驗：定位航行實驗全部結(jié)束后，次日進行空間探索實驗，撤去平臺，然后在第一象限相同的入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s 內(nèi)穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)，以及小鼠在平臺各象限停留的時間及游動距離，以此判斷小鼠空間記憶存儲及提取再現(xiàn)的能力。

三、統(tǒng)計學方法

四、結(jié)果

1.臨床及組織病理學表現(xiàn)：對照組小鼠皮膚未見異常（圖1A），顯微鏡下可見皮膚結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)正常（圖2A）。銀屑病組第2天背部皮膚為淡紅色，第3天出現(xiàn)紅斑、少許鱗屑，隨后皮膚逐漸出現(xiàn)皺褶、增厚，第4 ～6天，紅斑、鱗屑持續(xù)增多，第7天呈典型銀屑病樣改變（圖1B）；組織病理檢查顯示Munro小膿腫，表皮明顯角化過度及角化不全，棘層肥厚，伴有明顯毛細血管擴張和炎癥細胞浸潤（圖2B）。

2.銀屑病對小鼠空間學習能力的影響：Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，銀屑病組小鼠逃逸潛伏期為（38.24±13.59）s較對照組為（14.28± 3.80）s，兩組比較，t=5.37，P＜0.01。

3.銀屑病對小鼠空間記憶能力的影響：Morris水迷宮實驗結(jié)果見表1、圖3。銀屑病組平臺穿越次數(shù)明顯降低（P＜0.01），平臺象限停留時間（P＜0.05）及平臺象限游程（P＜0.01）均顯著低于對照組。銀屑病組在第二象限游程低于對照組（P＜0.05），在第四象限停留時間長于對照組（P＜0.05）；在一、三象限停留時間及游程兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

五、討論

圖1 咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型的皮膚表現(xiàn) 1A：對照組皮膚未見異常；1B：銀屑病組皮膚肥厚，表面大量脫屑圖2 咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型的組織學表現(xiàn)（HE×100）2A：對照組皮膚結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)正常；2B：銀屑病組呈典型的銀屑病病理表現(xiàn)

認知功能障礙是指多種原因引起的知覺、學習、記憶能力等嚴重減退，導致知識的獲取和應用障礙，常伴有行為學的異常［5］，包括不同程度的認知功能損害，從輕度認知功能障礙到癡呆。認知功能障礙對患者的影響遠遠大于單純的身體功能障礙。認知功能障礙通常隱匿起病，如果不早期發(fā)現(xiàn)，盡早干預，認知功能障礙可能進一步加重，發(fā)展到癡呆。研究表明，糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等許多疾病伴有認知功能障礙，并可以增加癡呆的發(fā)生風險［6-7］。銀屑病患者常伴有精神心理疾病和代謝性疾病等，使其具有更高的風險出現(xiàn)早期認知功能下降［8］，并且有研究表明，銀屑病已經(jīng)成為認知功能障礙的獨立危險因素［9］。有研究顯示，銀屑病患者輕度認知功能障礙發(fā)病率高達44%［2］，6%～48%的輕度認知功能障礙可以在1 ～3年內(nèi)進展為癡呆［10］，銀屑病患者比單純患有輕度認知功能障礙的患者出現(xiàn)癡呆的可能性更大［11］，并且認知功能障礙嚴重程度與銀屑病的嚴重程度呈正相關(guān)［9］。姚瑩等［12］的研究顯示，銀屑病患者的認知功能障礙發(fā)生率為30.2%，主要累及視空間功能和執(zhí)行能力兩個認知維度，視空間功能是對視覺信號包含的空間信息進行提取和闡釋的認知過程。

Morris 水迷宮實驗是行為神經(jīng)科學中應用最廣泛的評價動物空間學習記憶的實驗方法［13］。由于嚙齒類動物表現(xiàn)中的“視空間導航”過程也參與人類日常認知過程，因此Morris 水迷宮在認知受損的神經(jīng)退行性疾病研究中具有重要意義［14］。本研究為國內(nèi)外首次采用Morris水迷宮實驗評價銀屑病對小鼠認知功能的影響。潛伏期是Morris水迷宮定位航行階段的重要指標，潛伏期越短，預示著動物的學習空間能力越好。本研究顯示，銀屑病小鼠的定位航行潛伏期顯著增加，表明銀屑病小鼠的空間學習能力下降。在空間探索方面，動物在平臺位置穿越的次數(shù)越多，停留時間和游程越長，說明其空間記憶能力越好。銀屑病小鼠穿越平臺次數(shù)較正常小鼠明顯降低，平臺象限停留的時間及平臺象限游程均顯著下降，表明銀屑病小鼠空間記憶能力受到損傷。這一結(jié)果與既往結(jié)論“銀屑病患者用于評估視覺空間工作記憶的時間明顯延長［9］”相一致。

表1 應用Morris水迷宮實驗評估銀屑病對小鼠模型空間學習和記憶功能的影響（±s）

表1 應用Morris水迷宮實驗評估銀屑病對小鼠模型空間學習和記憶功能的影響（±s）

指標穿越平臺次數(shù)平臺象限停留時間（s）游程（mm）第一象限停留時間（s）游程（mm）第二象限停留時間（s）游程（mm）第四象限停留時間（s）游程（mm）對照組（n=10）5.00±1.76 19.37±5.00 500.34±117.09 9.34±3.74 237.31±77.82 20.54±5.45 489.16±188.82 11.42±2.81 251.80±64.00銀屑病組（n=10）1.70±0.95 13.34±4.60 251.29±71.59 11.54±3.75 206.13±51.84 21.77±6.62 309.97±126.49 14.02±1.81 290.84±78.97 t值5.21 2.80 5.74 1.44 1.05 0.46 2.49 2.46 1.22 P值＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05

圖3 對照組和銀屑病組小鼠水迷宮實驗運動軌跡 銀屑病組平臺穿越次數(shù)明顯低于對照組

越來越多的研究表明，小鼠的大腦皮層、皮層下區(qū)域以及海馬在Morris水迷宮實驗的空間學習和探索策略中發(fā)揮重要作用［15］。同樣，銀屑病患者在認知測試中出現(xiàn)無法用認知策略進行回憶信息的錯誤模式，與大腦皮層下額葉區(qū)域有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者前額皮質(zhì)可能存在結(jié)構(gòu)和功能的異常，其神經(jīng)影像學表現(xiàn)為雙側(cè)島葉皮層信號降低［2］。同時，伴有認知功能障礙的銀屑病患者大腦左半球海馬旁回、顳上回和額上回的腦厚度變薄，這些區(qū)域恰恰是認知功能的區(qū)域［2，16］。此外，認知功能障礙的出現(xiàn)也可能是由于銀屑病炎癥狀態(tài)所致，我們前期研究表明銀屑病患者不僅皮膚發(fā)生炎癥，而且全身也處于炎癥狀態(tài)，這種炎癥程度還與銀屑病嚴重程度呈正相關(guān)［17］。炎癥介質(zhì)已經(jīng)被證實在阿爾茨海默病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［18］，如超敏C反應蛋白、白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α很可能是引起相關(guān)神經(jīng)功能損傷的原因。已有研究證實，神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)是一個功能統(tǒng)一體，推測認知功能障礙是神經(jīng)遞質(zhì)和細胞因子相互作用、各個系統(tǒng)互相影響的結(jié)果。

本研究初步顯示銀屑病小鼠認知功能下降，局限性在于樣本量有限，未能對時間段、皮損嚴重程度與認知功能的關(guān)系進行分析，且本實驗僅選擇了一種銀屑病經(jīng)典模型，在未來研究中可以引入不同的銀屑病模型進行更深入的比較。銀屑病的發(fā)病機制較為復雜，而認知功能涉及機制廣泛，將來可以進一步開展銀屑病認知功能改變的機制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突