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      高活性抗菌、抗逆芽孢桿菌的篩選及其紫外誘變育種

      2019-12-19 08:58:04張文舉劉孟健鄭新霞盧奇成
      飼料工業(yè) 2019年23期
      關(guān)鍵詞:腸液脂肪酶芽孢

      姚 峻 張文舉 劉孟健 鄭新霞 盧奇成

      (石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子832000)

      近年來由于使用抗生素等藥物性飼料添加劑的弊端日益凸顯,人們將目光投向了無毒、無殘留及無抗藥性的益生菌制劑的研究與利用。目前,益生菌作為綠色飼料添加劑已被廣泛使用,菌種主要有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌[1]。其中,芽孢桿菌是一類能在逆境下形成休眠體芽孢以抵抗不良環(huán)境的革蘭氏陽性桿菌[2]。芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡單等優(yōu)點,同時在應(yīng)用的安全性、廣譜抗菌活性、穩(wěn)定性及分子加工易操作性等方面具有獨特的應(yīng)用優(yōu)勢[3-5]。本試驗主要根據(jù)益生菌的生物學(xué)特性,以7株芽孢桿菌為研究對象,通過抑制大腸桿菌能力為主要評價指標(biāo),輔以產(chǎn)酶特性及對人工胃液、人工腸液的耐受性進(jìn)行綜合評價,篩選出效果最優(yōu)的芽孢桿菌,并進(jìn)一步通過紫外誘變的方法提高其抑制大腸桿菌的能力[6-8],以期獲得生產(chǎn)性能更佳的菌株,為芽孢桿菌的新型飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      供試菌種:大腸桿菌K99由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院提供??莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌由中糧(昌吉)糧油工業(yè)有限公司研發(fā)中心饋贈。

      1.2 主要儀器與設(shè)備

      立式高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺、pH 計、菌落計數(shù)儀、高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、磁力攪拌器、分析天平。

      1.3 培養(yǎng)基

      LB 培養(yǎng)基(g/l):NaCl 10,酵母粉5,蛋白胨10,pH值7.0~7.2。

      發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l):豆粕20、玉米粉30、葡萄糖5、蛋白胨2、NaCl 2、KH2PO41.5、K2HPO41.5、(NH4)2SO40.3、CaCl20.3、MnSO40.1、吐溫-80 0.3、MgSO40.6,pH值8.0。

      1.4 試驗方法

      1.4.1 芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

      將7株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養(yǎng)基中進(jìn)化活化,調(diào)整搖床溫度至37 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,活化后的芽孢桿菌按3%(V/V)接種入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi),在37 ℃,180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后,取培養(yǎng)液10 ml,4 000 r/min 離心15 min,將上清液用0.2 μm無菌濾膜過濾得到無菌體發(fā)酵液。

      1.4.2 體外抑菌試驗

      芽孢桿菌對大腸桿菌K99體外抑菌定性實驗(抑菌圈試驗):往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養(yǎng)基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液,迅速混勻,然后傾注無菌平板,水平靜置待凝固后備用,每個處理分別重復(fù)3 次。將固體LB 平板分為均勻的8 塊區(qū)域,用1 ml 槍頭在試驗平板上打8 個孔,孔直徑約10 mm。用鑷子小心挑去培養(yǎng)基小塊以做成圓孔,往孔中注入7株芽孢桿菌的200 μl無菌體發(fā)酵液(對照組加等量滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基),放置37 ℃培養(yǎng)24 h。如果芽孢桿菌的無菌體發(fā)酵液對大腸桿菌有抑制作用,將在接種發(fā)酵液周圍出現(xiàn)無大腸桿菌生長的現(xiàn)象,出現(xiàn)明顯的抑菌圈,統(tǒng)計抑菌圈的直徑[9]。

      芽孢桿菌對大腸桿菌K99體外抑菌定量實驗:往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養(yǎng)基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液及30 ml的無菌體發(fā)酵液(對照組加等量的滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基),迅速混勻,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,在菌落計數(shù)儀上計數(shù),每個處理分別重復(fù)3次。

      抑制率(%)=(芽孢組菌落數(shù)-對照組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)×100

      1.4.3 粗酶液的制備

      7 株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養(yǎng)基中進(jìn)化活化,調(diào)整搖床溫度至37 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,活化后的芽孢桿菌按3%(v/v)接種入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi),調(diào)整搖床溫度至37 ℃,180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h 后,取培養(yǎng)液5 000 r/min,4 ℃離心20 min,離心取上清液,再用pH 值6.7 磷酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù),6 500 r/min,4 ℃離心5 min,吸取上清液待測酶活。

      1.4.4 蛋白酶活力的測定

      參照國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中附錄B《蛋白酶活力的測定福林法》[10]。

      1.4.5 淀粉酶活力、脂肪酶的測定

      按照淀粉酶、脂肪酶檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所,中國)的使用說明檢測。

      1.4.6 纖維素酶活力的測定

      參照NY/T 912—2004《纖維素酶制劑》中CMCNa DNS法纖維素酶活的檢測方法[11]。

      1.4.7 耐人工胃液能力測定

      從7株芽孢桿菌的LB斜面,接種一環(huán)于裝有50 ml的LB培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中,于pH=3的人工胃液中,搖勻后,放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,于120 min后取出相應(yīng)試管,搖勻后10倍梯度稀釋,從適當(dāng)梯度的稀釋液中,吸20 μl 涂板于培養(yǎng)基,放置15 min,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用菌落計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。

      1.4.8 耐人工腸液能力測定

      從7株芽孢桿菌的LB斜面,接種一環(huán)于裝有50 ml的LB培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中,于37 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h。取各個菌株培養(yǎng)液各3 ml,加入到pH=6.8的人工腸液中,搖勻后,放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,于120 min 后取出相應(yīng)試管,搖勻后10 倍梯度稀釋,從適當(dāng)梯度的稀釋液中,吸20 μl涂板于培養(yǎng)基,放置15 min,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用菌落計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。

      1.4.9 紫外誘變育種

      取培養(yǎng)24 h的出發(fā)菌株斜面,用接種環(huán)調(diào)取1環(huán)置于含有100 ml無菌生理鹽水的三角瓶中,180 r/min振蕩30 min,將其稀釋至1×108個/ml,備用。先打開超凈工作臺中20 W紫外燈預(yù)照30 min,以穩(wěn)定光線;取0.1 ml 菌懸液均勻涂布于LB 營養(yǎng)瓊脂平板上;然后取各組平板依次放在紫外燈垂直下方20 cm 處進(jìn)行紫外線誘變,照射時間為0、20、40、60、80、100、120、140 s。取紫外誘變后的菌液用無菌生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋,并取三個連續(xù)梯度10-3、10-4、10-5的菌液各0.1 ml涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基,將涂布好的培養(yǎng)基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中,避免光照,置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)照射的菌液涂布的平板為對照,測定細(xì)胞的致死率。選擇致死率在70%~80%左右的照射時間作為誘變處理時間。以最佳誘變處理時間對巨大芽孢桿菌進(jìn)行紫外誘變后,取稀釋后的菌液0.1 ml 涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基,將涂布好的LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中,避免光照,置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待菌落長出后,將所有平板上所有菌株轉(zhuǎn)接到LB 斜面培養(yǎng)基,置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)后的斜面上取菌苔一環(huán)接入LB液體培養(yǎng)基中,活化兩代。將活化后的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基管(20 ml/管),接種量為3%(V/V)。將發(fā)酵試管置于37 ℃搖床中180 r/min 培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后,離心過濾后獲取無菌體體發(fā)酵液,再進(jìn)行大腸桿菌K99體外抑菌定量實驗,獲得對大腸桿菌K99抑制率最高的誘變菌株。

      由于經(jīng)過紫外線誘變的菌株會在自身的修復(fù)作用下產(chǎn)生回復(fù)突變,所以為保證篩選的突變菌株有很好的穩(wěn)定性,要進(jìn)行傳代實驗以檢驗其性能。將篩選出的突變菌株連續(xù)培養(yǎng)5代進(jìn)行抑菌試驗,測定對大腸桿菌K99的抑菌率,評價突變菌株的遺傳性狀穩(wěn)定性。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 芽孢桿菌體外抑菌試驗結(jié)果

      芽孢桿菌對大腸桿菌K99 抑菌試驗結(jié)果如圖1所示。7株芽孢桿菌的發(fā)酵液對大腸菌K99的抑菌圈直徑的大小依次排序為:巨大芽孢桿菌>側(cè)孢芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌>納豆芽孢桿菌>凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌,其中巨大芽孢桿菌抑菌圈直徑最大,達(dá)到17.68 mm,側(cè)孢芽孢桿菌次之,達(dá)到17.02 mm,而凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌組并未出現(xiàn)明顯的抑菌圈,可能是由于這2株菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)過少或者產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對大腸桿菌K99 無顯著抑制作用,導(dǎo)致未產(chǎn)生明顯的抑菌圈。

      圖1 芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌試驗效果

      表1結(jié)果顯示:芽孢桿菌對大腸桿菌K99的抑菌圈直徑與抑菌率成正比,說明抑菌圈法與抑菌率檢測法都能較準(zhǔn)確的反應(yīng)芽孢桿菌的抑菌性能,并且2種檢測方法相關(guān)性較強(qiáng)。

      2.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶試驗結(jié)果

      芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力如表2所示。7株芽孢桿菌均能產(chǎn)生一定的蛋白酶,但產(chǎn)生的蛋白酶的種類和數(shù)量有所不同,總蛋白酶活力從大到小依次為:枯草芽孢桿菌>巨大芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌>凝結(jié)芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>側(cè)孢芽孢桿菌,總酶活力最高的為枯草芽孢桿菌,達(dá)到305.99 U/ml,其次為巨大芽孢桿菌,達(dá)到278.76 U/ml,總蛋白酶活力較低的是納豆芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌。有趣的是,巨大芽孢桿菌并不產(chǎn)生堿性蛋白酶,但卻能產(chǎn)生大量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶,使得其總酶活力較高。

      表1 芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑統(tǒng)計

      表2 芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力統(tǒng)計(U/ml)

      2.3 芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、產(chǎn)纖維素酶試驗結(jié)果

      芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、纖維素酶的能力如表3 所示。7 株芽孢桿菌的淀粉酶活力從大到小依次為:巨大芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>凝結(jié)芽孢桿菌>側(cè)孢芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌>納豆芽孢桿菌,淀粉酶活力最高的為巨大芽孢桿菌,達(dá)到45.28 U/ml,其次為枯草芽孢桿菌,達(dá)到42.96 U/ml,淀粉酶活力較低的是地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌。

      表3 芽孢桿菌的產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、產(chǎn)纖維素酶能力統(tǒng)計(U/ml)

      芽孢桿菌的脂肪酶活力從大到小依次為:地衣芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌>納豆芽孢桿菌>凝結(jié)芽孢桿菌>巨大芽孢桿菌>側(cè)孢芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌,脂肪酶活力最高的為地衣芽孢桿菌,達(dá)到28.36 U/ml,其次為枯草芽孢桿菌,達(dá)到22.79 U/ml,脂肪酶活力較低的是蠟樣芽孢桿菌,其幾乎不產(chǎn)脂肪酶。

      芽孢桿菌的纖維素酶活力從大到小依次為:枯草芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌>巨大芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>側(cè)孢芽孢桿菌>納豆芽孢桿菌>凝結(jié)芽孢桿菌,纖維素酶活力最高的為枯草芽孢桿菌,達(dá)到22.72 U/ml,其次為地衣芽孢桿菌,達(dá)到18.41 U/ml,纖維素活力較低的是納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌。

      2.4 芽孢桿菌對人工胃液的耐受性

      芽孢桿菌的人工胃液耐受能力如圖2 所示。地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌在pH=3的人工胃液中不但不致死,還能夠繁殖,說明這幾株芽孢桿菌具有極強(qiáng)的耐酸能力;納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的耐酸性也比較強(qiáng),達(dá)到了90%以上;耐酸性最弱的為側(cè)孢芽孢桿菌,存活率為85.26%。

      圖2 芽孢桿菌對人工胃液的耐受能力統(tǒng)計

      2.5 芽孢桿菌對人工腸液的耐受性

      芽孢桿菌的人工腸液耐受能力如圖3 所示。巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌在pH=6.9 的人工腸液中存活率達(dá)到90%以上。蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的人工腸液中存活率達(dá)到80%以上。人工腸液耐受性最差的是側(cè)孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌,兩者的存活率不足70%。

      圖3 芽孢桿菌對人工腸液的耐受能力統(tǒng)計

      根據(jù)檢測結(jié)果綜合分析,在本次研究的7 株菌中,巨大芽孢桿菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制大腸桿菌能力與較強(qiáng)的產(chǎn)酶特性及人工胃液、人工腸液的耐受性,其作為新型飼料微生態(tài)制劑的開發(fā)潛力較大,所以最終選擇巨大芽孢桿菌作為紫外誘變育種的研究對象,對其主要評價指標(biāo)抑制大腸桿菌的能力進(jìn)行優(yōu)化。

      2.6 紫外誘變結(jié)果

      2.6.1 紫外照射時間對巨大芽孢桿菌致死率的影響

      圖4 紫外照射時間與巨大芽孢桿菌致死率曲線

      由圖4 可知,當(dāng)紫外照射時間為80 s 時,巨大芽孢桿菌的致死率為78.15%,由于菌體致死率在70%至80%之間可能獲得較高的正向突變率。所以,選擇照射時間80 s為最佳誘變時間。

      2.6.2 紫外誘變后菌株的篩選

      由表4可知,巨大芽孢桿菌紫外誘變后獲得的28株菌中有2 株菌的抑菌率高于原始菌株,正突變率為7.14%。這兩株菌分別是UV-9和UV-26。菌株UV-9的抑菌率為88.39%,比原始菌株巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了3.63個百分點,菌株UV-26的抑菌率為90.92%,比原始巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了6.16個百分點。

      表4 紫外誘變后各菌株的抑菌率

      2.6.3 穩(wěn)定性試驗

      由表5 可知,傳代5 次后UV-26 菌株抑制大腸桿菌K99的能力基本保持穩(wěn)定,同時UV-26菌株除了產(chǎn)纖維素酶能力比出發(fā)菌株略有降低外,其產(chǎn)蛋白酶能力、產(chǎn)淀粉酶能力、產(chǎn)脂肪酶能力、耐人工胃液、耐人工腸液的能力相比出發(fā)菌株都略有提高,且基本保持穩(wěn)定。由此可見,紫外誘變后突變菌株UV-26獲得的優(yōu)良性狀基本可穩(wěn)定遺傳。

      表5 菌株UV-26的傳代穩(wěn)定性試驗結(jié)果

      3 討論

      本研究結(jié)果表明,7 種芽孢桿菌各自具有不同的生物學(xué)特性:巨大芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制大腸桿菌的能力,蛋白酶總活力最高的是枯草芽孢桿菌,淀粉酶活力最高的是巨大芽孢桿菌,脂肪酶活力最高的是地衣芽孢桿菌,纖維素酶活力最高的是枯草芽孢桿菌,耐人工胃酸能力最強(qiáng)的是地衣芽孢桿菌,耐人工腸液能力最強(qiáng)的是凝結(jié)芽孢桿菌。因此要根據(jù)芽孢桿菌的不同特性,在生產(chǎn)應(yīng)用上各有側(cè)重。在應(yīng)用芽孢桿菌制劑時,可以根據(jù)實際生產(chǎn)中的不同要求,選育具有不同優(yōu)良特性的芽孢桿菌菌株,如強(qiáng)抑制病原菌芽孢桿菌株、高產(chǎn)蛋白酶菌株、高產(chǎn)淀粉酶菌株、高產(chǎn)脂肪酶菌株、高產(chǎn)纖維素酶菌株、耐人工胃酸菌株及耐人工腸液菌株等。通過本次研究綜合分析,巨大芽孢桿菌在7 株菌中,抑制大腸桿菌能力最強(qiáng),產(chǎn)酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強(qiáng),具有作為新型飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開發(fā)潛力。今后,除了繼續(xù)在高產(chǎn)菌株篩選、誘變育種方面深入研究外,還應(yīng)利用基因工程技術(shù),有針對性的對芽孢桿菌的抗菌基因進(jìn)行克隆,使巨大芽孢桿菌菌株抑制病原菌的能力得到最大幅度的突破和提高。

      4 結(jié)論

      ①巨大芽孢桿菌在7株菌中,抑制大腸桿菌K99的能力最強(qiáng),產(chǎn)酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強(qiáng),綜合評定生物學(xué)特性最優(yōu)。

      ②進(jìn)一步對此株巨大芽孢桿菌進(jìn)行紫外線誘變處理,在處理時間為80 s時篩選得到1株抑制大腸桿菌效果最好的菌株UV-26,其抑菌率可達(dá)90.92%,比出發(fā)菌的抑菌率提高了6.16 個百分點,經(jīng)傳代、發(fā)酵試驗證明其遺傳性狀穩(wěn)定,適合用于新型微生態(tài)制劑產(chǎn)品的研發(fā)。

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