PGG通過激活Nrf2抗氧化通路保護(hù)AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷※

●童金枝 朱甜甜 徐夢強(qiáng) 金 勇 張紅燕 孫 敏

1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloy-β-D-glucose,PGG)是一種多酚類水溶性鞣質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等多種生物學(xué)活性，廣泛存在于多種藥用植物中[1-2]。本實驗室前期研究表明PGG可以結(jié)合系膜細(xì)胞[3]，但是其對系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。

AGEs（advanced glycation end products,AGEs）是由小分子葡萄糖上的醛基和大分子蛋白質(zhì)上的還原氨基在非酶環(huán)境下產(chǎn)生的非常穩(wěn)定且不可逆晚期糖基化終末產(chǎn)物[2]，糖尿病高血糖狀態(tài)下，AGEs 產(chǎn)生異常增加并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一系列級聯(lián)性的氧化應(yīng)激反應(yīng)，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制[4]。Nrf2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2)信號通路是一條抗氧化通路，其被激活后可啟動多種下游靶蛋白如HO-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、SOD(Superoxide dismutase,SOD)的表達(dá)[5]。這些被激活的靶蛋白可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，使機(jī)體從氧化狀態(tài)恢復(fù)到正常水平狀態(tài)[6]。

本實驗將以AGEs 誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞損傷模型，從Nrf2/HO-1信號通路探討PGG對小鼠腎小球系膜損傷細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株小鼠腎小球系膜MES 13（mouse mesangial cell）細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 藥物和試劑PGG（純度≥98%）（批號：BZP1001）購自合肥博美生物科技公司；兔GAPDH多克隆抗體（批號：BA2913）購自博士德生物技術(shù)公司、兔Nrf2多克隆抗體(批號：16396-1-AP)、兔Ho-1多克隆抗體（批號：10701-1-AP）、兔Histon-H3 多克隆抗體(批號：17168-1-AP)均購自Proteintech 公司、βactin單克隆抗體（批號：M52007M）購自Abmart公司；MDA(批號：A003-1)和T-SOD（批號：A001-1）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA 蛋白裂解液（批號：P0013B）購自碧云天生物技術(shù)公司；雙氯熒光黃乙酸乙酯（DCFH-DA）（批號：4091-99-0）購自SIGMA 公司；胰蛋白酶（批號：825J041）購自上海生工；高糖DMEM（批號：AE27193275）培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：Pro#NCI3225CH）和ECL發(fā)光液(批號：Prod#34095）購自Thermo 公司；小牛血清（fetal bovine serume,FBS）（批號：F8240-100）購自Solarbio 公司；牛血清白蛋白（bovine serum alumin,BSA）（批號：NA0332）購自Bomei公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器低溫離心機(jī)（Centrifuge 5417R）德國eppendorf）；低速離心機(jī)（SC-04）安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SynergyH1 全功能酶標(biāo)儀，美國Biotek儀器有限公司；5100B 可見紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；搖床（TS-1），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JS-1070P化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海培清科技有限公司；電轉(zhuǎn)模儀及電泳儀裝置，上海天能科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（CO-150），美國New Brunswick Scientific CO.,lnc。

2 方法

2.1 AGEs 制備將20mM 葡萄糖和40%BSA 溶于0.15mol/L磷酸鹽緩沖液中，37°C 避光孵育8周，用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 PGG 制備將PGG 溶于DMSO 中使其終濃度為20mM 的母液，再用PBS 稀釋為400μM 的工作液使用。

2.3 實驗分組及藥物處理用含有10%FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)細(xì)胞，將其置于37℃含5%CO2 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用于實驗。選取狀態(tài)良好，融合至80%左右的細(xì)胞用于實驗，實驗分為五組。正常對照組(Ctrl)：含10%FBS DMEM 培養(yǎng)48h；模型組(AGEs)：含終濃度為30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；給藥組：含終濃度為30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培養(yǎng)基中分別加入終濃度為分別為5μM (PGG-L)、10μM(PGG-M)、和20μM的PGG(PGG-H)，細(xì)胞共培養(yǎng)48h。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量測定[3]MES(150μL 含5×103)接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，去上清加不同濃度PGG 處理，每組設(shè)3個復(fù)孔。24h后，棄去培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板用預(yù)冷的PBS洗滌三次，并在含有DCFH-DA（10μM）的DMEM(不含酚紅)中溫育30min，然后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞并用不含酚紅的100μLDMEM 覆蓋。置酶標(biāo)儀于激發(fā)光485nm發(fā)射光530nm檢測熒光強(qiáng)度。

2.4.2 MDA 含量和SOD 活力測定 MES 以1.8×104個密度接種于24 孔板中，細(xì)胞貼壁后加不同濃度的PGG 處理。24h 后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照說明書檢測MDA含量和SOD活力。

2.4.3 分離細(xì)胞漿和細(xì)胞核[7]細(xì)胞按照上述方法分組處理后，用冰PBS 洗三次，收集細(xì)胞，200g 離心3min，棄上清加冷PBS，200g 離心10min，加低滲Buffer[含10mMHEPES（pH7.8）、10mM KCL、2mMMgCl、0.1mMEDTA、10mM Na2P2O4、1mM NaF、10mM β-glycerephosphate、3mMPMSF]，室溫2min 冰上10min，加10%NP-40手指輕彈，500g離心5min，取80%上清即為胞漿蛋白；棄去剩下20%上清，用含10%NP-40的低滲Buffer 將底部沉淀（含少量胞漿的細(xì)胞核）洗三遍，加 入 高 鹽Buffer[ 含50mMHepes、50mMKCl（pH7.4）、300mMNaCl、0.1mM EDTA、10%(V/V)甘油、10mM Na4P2O4、1mM NaF、10mM β-甘油磷酸、3mM PMSF]，并置于液氮中反復(fù)凍融三次，置冰上20min，20000g離心20min，取上清即為胞核蛋白。胞漿和胞核蛋白分別用BCA 試劑盒檢測蛋白含量，蛋白含量調(diào)一致。

2.4.4 Western blot 法檢測蛋白的表達(dá) 細(xì)胞按照上述方法分組處理后，冰PBS 洗三次，收集細(xì)胞，3000r/min 離心3min，棄去上清，加入適量RIPA 裂解液，置于冰上，超聲裂解提取蛋白，12000r/min 離心20min，保留上清，BCA 法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)節(jié)一致，加入上樣緩沖液，加熱煮沸5min，制成樣品。樣品經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC 膜，0.5%脫脂牛奶封閉1h，PBST 洗三次，一抗4℃冰箱孵育過夜，再用PBST 洗三次，室溫二抗孵育2h，PBST 洗三次，ECL 顯色液，JS-1070P 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照保存，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPadPrism5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（χ±SE）表示各組之間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)進(jìn)行檢驗，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 AGEs 對Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)時效關(guān)系結(jié)果如圖1 所示，與0h 比較，AGEs 刺激2-6hMES 細(xì)胞中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)量增加，12-72hMES 細(xì)胞中Nrf2、HO-1表達(dá)水平逐漸降低。AGEs孵育48h，MES細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)量較對照組顯著下降，且趨于穩(wěn)定，因此選用AGEs 處理48h 作為實驗?zāi)Ｐ徒M。

圖1 AGEs不同處理時間段對MES細(xì)胞中Nrf2和HO-1表達(dá)的影響

3.2 PGG對AGEs刺激的MES全細(xì)胞中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖2 所示，與Ctrl 組相比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.001，P＜0.05）。與AGEs組相比較，5、10、20μMPGG組Nrf2 蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴式增加，差異具有顯著性意義(P＜0.05，P＜0.001)，表明一定范圍內(nèi)PGG濃度越高，Nrf2 蛋白表達(dá)量越高。5、10μM PGG 組HO-1蛋白表達(dá)量較AGEs組相比增加但差異并無顯著性意義（P＞0.05），而20μM PGG 組HO-1 蛋白表達(dá)量較AGEs組顯著增加(P＜0.01)。

圖2 PGG對MES全細(xì)胞中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)的影響

3.3 PGG 對AGEs 孵育MES 細(xì)胞胞漿和胞核中Nrf2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖3所示，與Ctrl組相比，模型組胞漿、胞核中Nrf2 表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），5、10μM PGG 劑量組Nrf2 蛋白表達(dá)略有降低，但無顯著性意義（P＞0.05），二20μM PGG組Nrf2表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.05）；5、10、20μM PGG 處理使細(xì)胞核中Nrf2 蛋白表達(dá)量顯著增加，且呈劑量依賴方式。

圖3 PGG對MES胞漿及胞核中Nrf2蛋白表達(dá)的影響

3.4 PGG 對AGEs 刺 激 的MES 細(xì) 胞 中ROS、MDA、SOD的影響與Ctrl組相比較，模型組ROS含量極顯著升高（P＜0.001），MDA 含量顯著升高（P＜0.05），SOD 含量顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，ROS 和MDA 含量均隨PGG 濃度增加而逐漸降低（P＜0.001）；SOD 活力隨PGG 濃度增加而升高，其中5μM PGG 組較與模型組比較無明顯差異（P＞0.05），而10、20μM PGG 組SOD 活力顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。數(shù)據(jù)見表1。

表1 PGG對細(xì)胞中ROS、MDA、SOD表達(dá)水平的影響（χ±s，n=3）

4 討論

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致腎衰竭及終末期糖尿病發(fā)展的主要原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康安全[8-9]。誘發(fā)糖尿病腎病的因素多種，高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及功能障礙是主要因素[8]，氧化應(yīng)激是引發(fā)糖尿病腎病的根本原因。許多證據(jù)表明，在糖尿病發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激起核心作用[13]。細(xì)胞在高糖和AGEs狀態(tài)下產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起大量細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。研究表明，具有強(qiáng)抗氧化性的白藜蘆醇可以顯著抵抗糖尿病腎纖維化進(jìn)展，從而抑制DN 的發(fā)展，其機(jī)制是激活Nrf2抗氧化信號通路，猝滅由AGEs誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞、減緩DN發(fā)展的作用[14]。

細(xì)胞內(nèi)有氧化系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)，氧化系統(tǒng)可產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。為了抵抗和清除細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基，機(jī)體建立了一個獨立完整的防御系統(tǒng)，即抗氧化系統(tǒng)，抗氧化系統(tǒng)不僅可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基帶來的傷害還能有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)?？寡趸到y(tǒng)與氧化系統(tǒng)之間的不平衡可能導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)修飾和DNA損傷，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷及功能障礙[15]。Nrf2 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)因子，調(diào)控許多Ⅱ相代謝酶及抗氧化基因的表達(dá)以維持體內(nèi)平衡[16]?；蚯贸ㄒ炎C明了其通用的細(xì)胞保護(hù)特征，正常情況下Nrf2 和Keap1 (kelch-like ECH-associated protein-1)結(jié)合以非活性狀態(tài)存在于胞漿中且轉(zhuǎn)錄活性較低，當(dāng)細(xì)胞受到ROS 或其他有害刺激后，Nrf2 發(fā)生磷酸化，致使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2以非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，由胞漿進(jìn)入胞核，與核內(nèi)抗氧化原件(antioxidant response elements,ARE) 結(jié)合，啟動下游多種靶蛋白的表達(dá)。這些靶蛋白能在被激活后調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，使機(jī)體從氧化應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)[6]。Xie 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸(carnosic acid,CA)作用于AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，發(fā)現(xiàn)CA組胞漿中Nrf2下降，胞核中Nrf2增加，且HO-1 表達(dá)水平升高，炎癥因子下調(diào)。Kim 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素通過激活Nrf2，進(jìn)而促進(jìn)HO-1 的表達(dá)，從而降低AGEs 刺激小鼠系膜細(xì)胞引起的炎癥損傷。

Nrf2 在AGEs 誘導(dǎo)的炎癥中起作用，它可上調(diào)細(xì)胞血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免受炎癥損傷[14]。HO-1是Nrf2調(diào)節(jié)的Ⅱ相解毒酶之一，由它引起的下級信號通路具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。上調(diào)的HO-1 可將血紅素降解成膽綠素、CO和Fe2+，CO作為NF-kB途徑的抑制劑，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)量降低，而膽紅素也作為抗氧化劑。此外，HO-1直接抑制促炎癥細(xì)胞因子以及激活抗炎細(xì)胞因子，使炎癥過程達(dá)到平衡[19]。SOD是受Nrf2調(diào)控的抗氧化蛋白酶，屬于一種金屬酶，是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號殺手。SOD 通過歧化反應(yīng)將超氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和H2O，H2O2在過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GS-Px)作用下生成H2O，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[6]。研究證實，MDA是氧自由基ROS攻擊生物膜中不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而形成的脂質(zhì)過氧化物，其含量的升高會進(jìn)一步引發(fā)氧自由基ROS 的產(chǎn)生[13]，因此MDA 的含量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度，SOD活力的升高將引起MDA含量的下降。激活Nrf2下游抗氧化蛋白如HO-1、SOD 的表達(dá)，可降低ROS、MDA 產(chǎn)生并減少氧化損傷，發(fā)揮抗氧化保護(hù)細(xì)胞的作用。Nrf2 抗氧化信號通路對DN 起著重要保護(hù)作用，增強(qiáng)Nrf2 抗氧化通路途徑可緩解DN 的發(fā)展[8,20]。Zheng[12]等研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的活化不僅可以改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型中的代謝紊亂，還可以減少高葡萄糖介導(dǎo)的系膜細(xì)胞外基質(zhì)積累及ROS 產(chǎn)生，從而達(dá)到治療DN的作用。

本實驗結(jié)果表明PGG 能增加細(xì)胞中Nrf2、HO-1的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2 向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，降低氧化應(yīng)激。提示PGG 通過激活Nrf2/HO-1 抗氧化信號通路保護(hù)系膜細(xì)胞損傷。