石和榮，何琪，呂晴霽，彭激夫，梁添發(fā)，陳奕彬，柳小春，楊宇晴，劉蘇，張海發(fā)，王慶，趙會宏

（1.廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心，廣東 惠州 516081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.廣東天地本草飼料科技有限公司，廣東 中山 528400）

虎龍雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）生長快、成活率高、肉質(zhì)鮮美人工養(yǎng)殖得到了快速發(fā)展[1]。但隨著石斑魚養(yǎng)殖業(yè)集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，近海污染嚴(yán)重，養(yǎng)殖過程中疾病頻發(fā)，抗生素或化學(xué)藥物的濫用等對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生了不良影響，嚴(yán)重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。

中草藥是一種天然綠色飼料添加劑，包含生物堿、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)油等多種活性成分[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)黃芪Astragalus membranaceus、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia、金銀花Lonicera japonica 等多種中草藥能不同程度地提高水產(chǎn)動物的免疫力及生長性能[4,5]。如李華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，投喂一定量的牛膝等中草藥可顯著提高大菱鲆Scophthalmus maximus 的免疫力。核苷酸被稱為條件營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)動物體內(nèi)源核苷酸合成不足時(shí)，需要來源于飼料的外源核苷酸加以補(bǔ)充，是一種新型綠色飼料添加劑[7]。目前，飼料中添加核苷酸對奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.areus）[8]、大菱鲆[9]等養(yǎng)殖魚類生長及免疫的影響已有報(bào)道。大多數(shù)研究表明：飼料中添加核苷酸能進(jìn)水產(chǎn)動物的生長發(fā)育，提高其免疫力?；堧s交斑是近年推廣的水產(chǎn)養(yǎng)殖石斑魚品種，關(guān)于中草藥或核苷酸對其作用效果報(bào)道較少。

本試驗(yàn)通過研究在飼料中添加一種復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長及免疫功能的影響，以期為探索虎龍雜交斑循環(huán)水養(yǎng)殖中的病害防控技術(shù)，提高石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖的存活率和抗病力，以及探究水產(chǎn)動物的高效養(yǎng)殖提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

石斑魚基礎(chǔ)料（RUBY 牌）委托廣東越群飼料公司定制（表1）；復(fù)合中草藥添加劑由板藍(lán)根、黃岑、黃芪、忍冬藤、白芷、甘草共6 種中草藥按比例為1∶1∶1∶1∶1∶1 復(fù)配而成（由廣東天地本草飼料科技有限公司提供），經(jīng)中藥粉末專用氣旋篩粉機(jī)加工，細(xì)度達(dá)到300 目。核苷酸（瑞士CHEMOFORMA 公司提供）由純化胞苷酸、純化腺苷酸、純化胸苷酸、純化鳥苷酸、純化鳥苷酸、純化核糖核酸按等質(zhì)量比例（1∶1∶1∶1∶1∶1）復(fù)配而成。添加劑先與粘合劑混勻（粘合劑為a-淀粉，兩者比例為1∶0.2），然后在基礎(chǔ)飼料中分別加入2 g/kg、4 g/kg復(fù)合中草藥添加劑和4 g/kg 核苷酸添加劑，混合均勻，噴灑少量水霧，使其與飼料粘合，經(jīng)小型制粒機(jī)制成粒徑為3 mm 的顆粒型膨化飼料，風(fēng)干后置于-4℃的冰箱中冷藏，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成和營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Ingredient and utrition level of basal feed（on airdry basis）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)管理

試驗(yàn)在廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)開始前，將平均質(zhì)量（22.36±0.07）g 的試驗(yàn)魚饑餓24h，挑選由中心提供的600 尾大小均勻、健康的雜交石斑魚放養(yǎng)于12個(gè)養(yǎng)殖桶中（有效養(yǎng)殖水體0.55 m3），每桶50 尾，隨機(jī)分為4 組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。馴化一周后開始正式試驗(yàn)。正式試驗(yàn)時(shí)，每天早上8:30 和下午4:30各飽食投喂1 次，攝食5min 后，在養(yǎng)殖桶或網(wǎng)內(nèi)設(shè)置投料籃，收集殘餌，記錄殘餌數(shù)量。每日記錄各試驗(yàn)組投餌量、死亡率等，養(yǎng)殖周期為56 d。整個(gè)養(yǎng)殖過程中水溫為27.05～31.05℃，溶解氧為5.40～7.70mg/L，pH 為7.50～8.20，氨氮濃度小于0.3mg/L。

1.3 樣品采集與處理

采樣前停喂24h，將養(yǎng)殖桶內(nèi)的試驗(yàn)魚全部撈出，統(tǒng)計(jì)尾數(shù)和試驗(yàn)魚總質(zhì)量。從每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)選取20 尾魚測量體質(zhì)量、體長等生長性能指標(biāo)。然后，用1.0mL 的注射器抽取尾靜脈血液，注射于1.5mL 的離心管中，4 ℃下靜置4h 后，以5 000r/min離心10min，取上層清液分裝0.5mL 的離心管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ媒?jīng)過滅菌滅酶處理的采樣工具按順序解剖稱量內(nèi)臟和肝臟質(zhì)量，并將其前腸與肝胰臟、脾臟、腎臟三個(gè)免疫器官分別放入2mL 離心管中于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中備用。再將解剖后的魚去皮取背部肌肉，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能的計(jì)算

1.4.2 肌肉常規(guī)檢測

粗蛋白含量用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量用索氏抽提法測定。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

血清溶菌酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.4.4 mRNA 的相對表達(dá)量

采用熒光定量PCR 法測定虎龍雜交石斑魚肝胰臟、脾、腎中干擾素γ（IFN-γ）、熱休克蛋白70（HSP70）、白細(xì)胞介素β（IL-1β）相關(guān)基因的表達(dá)水平。用Magen 公司的Hipure Universal RNA Kits 試劑盒提取總RNA。用核酸濃度分析儀測定核酸溶液的A260/A280的比值即為核酸純度，其范圍在1.8～2.0之間，自動記錄各濃度。用瓊脂凝膠法檢測RNA 的質(zhì)量。提取1μg 樣品RNA 后采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒（含去除基因組中殘留DNA 步驟）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI/Primer-BLAST 上進(jìn)行比對，選擇特異性引物。所設(shè)計(jì)引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 引物序列見表2。以cDNA 為模板，采用熒光定量PCR 法，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScriptTip Green qPCR Super Mix 試劑盒測定肝胰腺、脾、腎、組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、γ-干擾素（IFN-γ）和熱休克蛋白70（HSP70）免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)水平。20 μL 的反應(yīng)體系包括：10 μL 2×TransScriptTip Green qPCR Super Mix、0.4 μL Forward Primer（10 μM）、0.4 μL Reverse Primer（10 μM）、0.4 μL Passive Reference Dye（50х）、1 μL cDNA 和7.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94℃30s、94℃5s、58℃15s、72℃10s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3 次分析。采用的2-△△CT法計(jì)算各目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR 引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，用Excel 2018 軟件進(jìn)行處理，通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）,并進(jìn)行Duncan 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長性能的影響

由表3 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚的體質(zhì)量增重率、特定生長率無顯著影響（P＞0.05），但顯著提高了虎龍雜交石斑魚的成活率（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組飼料系數(shù)顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組、4g/kg 核苷酸組肥滿度和臟體比顯著高于對照組（P＜0.05）；各組間虎龍雜交石斑魚肝體比無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表4 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸的處理組肌肉蛋白和脂肪含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶的影響

由表5 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸組魚血清溶菌酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），其中4 g/kg 核苷酸組最高。

2.4 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖1、圖2 和圖3。添加復(fù)方中草藥或核苷酸的飼料總體上提高了虎龍雜交石斑魚3 個(gè)器官細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)。2g/kg 中草藥組腎臟中HSP70、IL-1β 及脾臟中IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），4g/kg 中草藥組肝中IL-1β 表達(dá)量顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；腎臟和脾臟中IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），4g/kg 核苷酸組脾中HSP70和IL-1β 表達(dá)量顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；脾的IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長性能的影響Tab.3 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on growth performance of hybrid grouper

表4 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚肌肉營養(yǎng)成分的影響Tab.4 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on muscular proximate composition of hybrid grouper

圖1 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚HSP-70 表達(dá)的影響Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine and nucleotides on the expression of HSP-70 in hybrid grouper

圖2 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚IL-1β 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IL-1β in hybrid grouper

圖3 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚IFN-γ 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IFN-γ in hybrid grouper

3 討論

3.1 添加復(fù)方中草藥對虎龍雜交石斑魚的影響

3.1.1 生長性能

本試驗(yàn)中，在飼料中添加含有板藍(lán)根、黃芪、黃岑等的復(fù)方中草藥，虎龍雜交石斑魚的體質(zhì)量增重率和特定生長率增加不明顯，但復(fù)方中藥的添加量為4g/kg 時(shí)，飼料系數(shù)降低了5.2%，存活率也顯著增加。這說明，飼料中添加適量的復(fù)方中草藥或核苷酸能在維持虎龍雜交石斑魚正常生長的同時(shí)，又大大增強(qiáng)了其抗病能力。徐安樂等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加含有大黃、金銀花和黃芪等的復(fù)方中草藥，對珍珠龍膽石斑魚（E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀）的促生長效果不顯著，僅降低了餌料系數(shù)。而吳彬等[11]以含有0.5%黃芩、0.5%金銀花、0.5%板藍(lán)根、0.5%黃芪等氮等能飼料分別投喂吉富羅非魚Oreochromis niloticus 幼魚發(fā)現(xiàn)，各組魚體增重、特定生長率顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低，其中黃芪組各項(xiàng)生長指標(biāo)顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。馬國紅等[12]探究了板藍(lán)根、黃芪、甘草等對鯉Cyprinus carpio 生長性能及其體成分的影響，認(rèn)為適宜添加復(fù)方中草藥可以促進(jìn)魚類生長，降低飼料系數(shù)。綜上所述，飼料中添加適量的中草藥能不同程度地促進(jìn)水產(chǎn)動物生長，而給藥劑量不同，可能與添加中草藥種類和養(yǎng)殖對象的不同有關(guān)。中草藥中含有的多糖類、有機(jī)酸、生物堿、黃酮類能增加動物體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)機(jī)體血紅蛋白、血清總蛋白的合成。中草藥可影響水產(chǎn)動物胃腸道內(nèi)常在菌群的狀態(tài)，維護(hù)動物腸道健康，優(yōu)化腸道對營養(yǎng)成分的吸收，促進(jìn)水產(chǎn)動物的健康生長[3]。

3.1.2 免疫能力

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要來源于吞噬細(xì)胞，能破環(huán)細(xì)菌、真菌、病毒以及寄生物結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)魚體的抗病能力。溶菌酶活性的高低直接顯示溶菌作用的強(qiáng)弱，可以代表機(jī)體免疫功能的狀況[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，黃芪、黃岑中含有多糖、生物堿等營養(yǎng)成分，能有效促進(jìn)相關(guān)免疫酶的合成。中草藥可提高水產(chǎn)動物血液中溶菌酶活性的研究報(bào)道屢見不鮮。李華等[6]以牛膝、板藍(lán)根、甘草等中草藥制成免疫增強(qiáng)劑投喂大菱鲆Scophthalmus maximus，顯著提高了其溶菌酶活性。李梅芳[15]等選用黃芪、黃岑等中草藥投喂大黃魚Pseudosciaena crocea，各組魚溶菌酶活性顯著上升，這與本研究結(jié)論相似。但在本試驗(yàn)中，隨著復(fù)方中草藥含量的增加，溶菌酶活性有所減少，其原因可能與使用劑量有關(guān)，復(fù)方中草藥超過一定用量后是否會抑制血清溶菌酶的活性，有待下一步試驗(yàn)探索。

相關(guān)研究表明：復(fù)方中草藥中的某些物質(zhì)能誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)。IL-1β 作為IL 家族重要的一員，是最早表達(dá)的一個(gè)炎性細(xì)胞因子，它能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的生長以及分泌一些細(xì)胞因子來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，殺滅病原，起到抗細(xì)菌、病毒、腫瘤的作用[16]。一定量的黃芪、板藍(lán)根、蒲公英等中藥多糖對IL-1β 的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[17]。在哺乳動物中，IFN 可以分為α、β、γ 三種類型，三者均有抗病毒活性。其中，IFN-γ 為Ⅱ型對干擾素是一個(gè)單基因家族，在免疫調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。HSP70 是熱休克蛋白家族最重要和保守的蛋白，扮演著細(xì)胞因子和分子伴侶的雙層身份。很多研究報(bào)道，HSP70 具有多種生物學(xué)活性和功能，包括分子伴侶、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、提高機(jī)體耐受力、對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等功能[18]。帥學(xué)宏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿多糖提高了小鼠血清中IL-1β 和IFN-γ 質(zhì)量濃度。王家敏[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、當(dāng)歸等復(fù)方中草藥能誘導(dǎo)吉富羅非魚Hsp70 和IL-1β 基因在頭腎、肝臟、胸腺、鰓和脾臟組織中表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在飼料中添加復(fù)方中草藥誘導(dǎo)虎龍雜交石斑魚IL-1β、IFN-γ、HSP70 三種免疫相關(guān)基因在腎臟、脾臟組織中的合成與分泌。

3.2 添加核苷酸對虎龍雜交石斑魚的影響

3.2.1 生長性能

核苷酸是動物體內(nèi)不可缺少的重要部分，它廣泛參與動物體內(nèi)供能、脂肪代謝等生命過程，提供魚體快速生長時(shí)細(xì)胞復(fù)制所需的核苷酸，可增強(qiáng)代謝酶活性，促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率等[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加4 g/kg 的核苷酸，對虎龍雜交石斑魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)無顯著性影響。與對照組相比，質(zhì)量增重率、特定生長率分別增加7.24%和4.06%，且存活率顯著增加。韓春梅等[8]和Lin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定量的核苷酸能顯著促進(jìn)奧尼羅非魚幼魚和點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus malabaricus 的生長，但是各種試驗(yàn)結(jié)果也不盡一致。Safar 等[23]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加核苷酸對細(xì)長爪鰲蝦Astacus leptodctylus 的促生長作用不明顯。在本試驗(yàn)中，添加外源核苷酸沒有顯著促進(jìn)虎龍雜交石斑魚的增重率和特定生長率，但較對照組略有增加。成活率的顯著性增加，說明一定量的核苷酸能有效增強(qiáng)虎龍雜交石斑魚的免疫力。據(jù)推測，核苷酸在水產(chǎn)動物中促生長效果可能存在種系的差異。有關(guān)外源核苷酸對石斑魚的生長性能研究報(bào)道較少，其作用機(jī)理尚不清楚，有待更深入的研究。

3.2.2 免疫能力

向梟等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加519.85～774.00 mg/kg 核苷酸能提高鯉血清溶菌酶活性；曹俊明等[25]研究表明，飼料中添加0.8 g/kg 外源核苷酸可顯著提高凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 血清中溶菌酶活性，增強(qiáng)非特異性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。本研究表明，飼料中添加4 g/kg 核苷酸對虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶活性雖無顯著影響，但與對照組相比增加了38.38%。這是否與試驗(yàn)魚種、飼料組成、試驗(yàn)條件、核苷酸的劑量及劑型不同有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，投喂核苷酸能誘導(dǎo)IL-1β、IFN-γ 和HSP70 三種免疫相關(guān)基因在虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟組織中的合成與分泌，這與Reda 等[26]的研究結(jié)果相一致。目前，關(guān)于外源核苷酸影響機(jī)體非特異性免疫功能的機(jī)理還不清楚，究其原因可能是參加免疫的大部分細(xì)胞合成的核苷酸不能滿足所需，影響了吞噬細(xì)胞和白細(xì)胞等的增殖、分化和活力以及紅細(xì)胞的數(shù)目。

3.3 結(jié)論

基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸可維持虎龍雜交石斑魚的正常生長，顯著提高其成活率（P＜0.05）；其中4g/kg 中草藥飼料系數(shù)顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥、4g/kg 核苷酸能顯著增加魚體肥滿度和臟體比（P＜0.05）；4g/kg 復(fù)方中草藥、2g/kg 中草藥或4g/kg 核苷酸能增強(qiáng)虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟中IL-1β、IFN-γ、HSP70 免疫相關(guān)基因的表達(dá)，其中，2g/kg 中草藥添加劑的增強(qiáng)效果更明顯。綜上所述，2g/kg、4g/kg 的復(fù)方中草藥添加量能有效促進(jìn)虎龍雜交石斑魚生長，具有一定的增強(qiáng)免疫效果。